HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoRⅠ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体。分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc]。对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Westernblot检测HLA-DR1的表达。结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。ELISA和Westernblot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象。结论成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础。

HLA-DRB1结合性变构肽对T细胞活化的竞争性抑制作用

目的:研究去除T细胞受体(TCR)识别表位的HLA-DRB1结合性Ⅱ型胶原(CⅡ)变构肽对T细胞活化的抑制作用.方法:将人CⅡ的抗原性片段(CⅡ263-272)中与T细胞识别有关的268～270位氨基酸分别用丙氨酸和甘氨酸替换,形成CⅡ变构肽S268-270,并将该多肽与表达HLA-DR1的抗原呈递细胞(APC)及抗原性原型CⅡ263-272多肽共同孵育,研究变构肽S268-270在竞争性抑制CⅡ263-272与HLA-DR1分子结合中的作用;利用HLA-DR1转基因APC及其特异性T细胞,研究S268-270对抗原性CⅡ263-272及流感病毒血凝素(HA)306-318诱导的T细胞活化的抑制作用.结果:CⅡ变构肽S268-270可结合APC表面的HLA-DR1分子,并可抑制CⅡ263-272及HA306-318两种不同抗原诱导的HLA-DR1限制性T细胞活化.结论:替换CⅡ263-272中与TCR识别有关的氨基酸所形成的CⅡ变构肽S268-270可与APC表面的HLA-DR1分子结合,并可抑制HLA-DR1结合性抗原肽CⅡ263-272及HA306-318诱导的T细胞活化.CⅡ变构肽S268-270可能对类风湿关节炎患者的HLA-DR1限制性T细胞异常活化具有抑制作用.

DNA芯片技术检测HLA-DR1,DR51组基因型

目的 采用DNA芯片技术对HLA DR1,DR5 1组基因分型。 方法 根据编码HLA DR1,DR5 1组抗原等位基因序列设计特异分型探针 ,制作DNA分型芯片。通过组间特异引物扩增基因组相应区段DNA ,扩增中用Cy5 dCTP荧光标记 ,扩增标记后的产物与芯片探针杂交 ,通过杂交产生的荧光信号及分布格局确定样品基因亚型。分型结果用标准DNA和PCR SSO验证。 结果 130份样本共检出HLA DR1,DR5 1组位点 34个 ,包括 18个DR15 ,8个DR16 ,6个DR10 ,2个DR1,无假阳性或假阴性 ,准确率和重复率均达 10 0 %。检测总耗时约 3.5h。 结论 DNA芯片用于HLA DR1、DR5 1组基因分型具有高分辨度、高特异性和简单快速的优点 ,适于器官移植临床应用。

人类白细胞抗原DRB1和DQB1基因与自身免疫性甲状腺疾病易感性的关系

目的 探讨自身免疫性甲状腺疾病的遗传易感性与人类白细胞抗原 (HLA) DRB1、HLA DQB1基因之间的相关性。方法 应用聚合酶链反应 序列特异性引物 (PCR SSP)技术对已经确诊的湖北汉族儿童桥本甲状腺炎 46例、Graves病 2 0例、单纯性甲状腺肿 2 7例和正常对照组 193名进行HLA DRB1、HLA DQB1基因多态性分析。结果 桥本甲状腺炎患儿组HLA DRB1 0 90 1、HLA DQB1 0 80X和HLA DQB1 0 30 3等位基因频率较正常对照组显著增高 (统计学分析分别为 6 7%、2 8.5 % ,RR =5 .2 ,P =1.9× 10 -6;39%、16 .1% ,RR =3.4,P =1.0× 10 -3 和 5 6 %、35 .0 % ,RR =2 .4,P =1.1×10 -3 )。Graves病患儿组则仅见HLA DRB1 0 90 1基因频率较正常对照组显著增高 (6 5 %、2 8.5 % ,RR =4.7,P =1.8× 10 -3 )。结论 桥本甲状腺炎和Graves病的发病与HLA DRB1 0 90 1密切关联 ,且桥本甲状腺炎的发病还与HLA DRB1 0 80X和HLA DQB1 0 30 3关联。提示它们是中国湖北汉族人自身免疫性甲状腺疾病的易感基因。

类风湿关节炎共同表位QK/RRAA对蛋白激酶A通路的抑制作用

目的 研究类风湿关节炎 (RA)共同表位QK/RRAA及其变异对细胞内蛋白激酶A(PKA)信号通路的影响。方法 测定HLA DRβ1 0 40 4及其变异体转基因细胞内PKA、cAMP及腺苷环化酶 (AC)的浓度及活性。结果 HLA DRβ1 0 40 4转基因细胞的PKA活力、cAMP水平及AC活力明显低于HLA DRβ1 0 40 3转基因细胞株 (P <0 0 1)。HLA DRβ1 0 40 4序列第 70～ 74位氨基酸QRRAA中的Q70 及A74 是抑制PKA信号通路的关键氨基酸。结论 类风湿关节炎共同表位QK/RRAA的表达可抑制PKA、cAMP和AC的活性 。