eEF2K、HLAⅠ及β_(2)-MG在胃腺癌中的表达及临床意义

目的探讨eEF2K、人类白细胞抗原I类基因(HLAⅠ)及β_(2)-微球蛋白(β_(2)-MG)在胃腺癌中的表达及临床意义。方法收集我院病理诊断为胃腺癌的240例组织标本为胃腺癌组,同时收集距离肿瘤5cm处的正常胃黏膜标本89例为对照组。根据错配修复蛋白MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表达情况,将胃腺癌组标本分为MSI及非MSI组。采用免疫组化染色方法检测各组eEF2K、HLAⅠ及β_(2)-MG蛋白的表达,分析各指标与临床病理参数之间的关系。结果240例胃腺癌标本中,男155例,女85例;年龄32~90岁,平均62岁,其中高分化1例,中分化77例,低分化162例。与对照组相比,非MSI组及MSI组e EF2K、HLAⅠ及β_(2)-MG的表达均显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05);与非MSI组相比,MSI组e EF2K的表达阳性率显著降低(P<0.05)。HLAⅠ蛋白表达与脉管侵犯有关(P<0.05),而e EF2K的表达率升高提示组织学分化较差(P<0.05)。结论e EF2K、HLAⅠ及β_(2)-MG蛋白在胃腺癌的发生发展过程中起促癌的作用,并与组织学分化较差及预后相关。

HLAⅠ基因型配合输注策略用于免疫性血小板输注无效的实验研究

目的利用血小板供者HLA基因分型库,针对PTR患者建立供受者HLA-A、B位点基因配合型输注策略,以提高临床血小板输注疗效。方法以血清学交叉配合试验作为免疫性PTR的初筛手段,对初筛阳性的35例PTR患者采取血小板基因配型策略,其中24例进行HLA-A、-B基因分型和血小板HLAⅠ类抗体检测,根据患者血小板基因型和供者特异性抗体(DSA)回避策略以及供受者CREG配合等级原则,在单采血小板因型数据库中搜寻配合型供者,其中DSA回避优先于CREG等级原则,共计83次输注。其余11例患者仅按照HLA交叉反应组CREG的配合等级原则选择供受者HLA-A,-B抗原基因型相合的供者,共计55次输注。回访临床患者相关资料及基因配型的血小板输注效果,统计分析校正的血小板计数增值(CCI)。结果对临床送检的35例PTR患者先后进行了453次ABO同型的血清学交叉配合试验,人均为12.94次(453/35),每次血小板交叉配型的供者平均人数为4.21(1908/453)人,血清学交叉配合试验阳性率为69.86%(1333/1908)。其中对24例患者标本进行了HLAⅠ类抗体检测,仅有1例标本为抗体阴性,即HLAⅠ类抗体阳性检出率为95.83%(23/24),且平均每个患者有(44.37±22.31)种特异性抗体;根据患者血清中抗体荧光强度值的高低,抗体为强阳性17例、阳性20例、弱阳性23例,其对应的检出率分别为73.91%(17/23)、86.96%(20/23)和100%(23/23)。138次HLA基因配合型输注后的血小板首次计数CCI均值为14.08±11.12[(23.95±21.28)h],高于1h CCI(>7.5有效)或24h CCI(>4.5有效),且DSA回避组输注效果(首次计数CCI为15.56±11.00)显著优于非DSA回避组(首次计数CCI为11.86±12.00)(P<0.05)。在所有患者输注中,49.28%的输注同时存在1种或多种非免疫因素。结论HLA-I基因配型血小板输注策略是预防和改善免疫相关性血小板输注无效的可行方法,对于多次输血且血小板相关抗体初筛阳性的患者,采取DSA回避和供受者CREG配合型输注策略可显著提高输血疗效,为临床提供血小板精准输注。

肝癌组织中HLAⅠ类抗原及相关分子的表达

目的研究在抗原提呈过程中HLAⅠ类抗原各相关分子的表达水平及临床意义。方法利用免疫组织化学法(ABC法)对165例肝癌的石蜡组织标本中HLAⅠ类分子的重链、轻链及抗原提呈相关分子calnexin、LMP2等的表达情况进行研究,并分析各表达分子的相关性。结果HLAⅠ类分子(A和B/C位点)的表达为膜型,β_2M的表达为膜浆型,以膜为主,而LMP2和calnexin的表达为浆型。肝癌组织除LMP2分子外,HLAⅠ类各分子均有明显的上调(上调率≥40%),其中以HLAⅠ类分子A位点上调最明显(54%)。肝癌组织中HLAⅠ类各分子之间表达趋势一致。结论肝癌表面HLAⅠ类分子表达增加与抗原提呈过程中多分子的表达增加和协同作用有关,而并非由其中某种单一分子的改变来决定。

原癌基因Bmi-1 B细胞抗原表位及HLAⅠ类限制性CTL表位的生物信息学分析

目的:预测原癌基因Bmi-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1)的B细胞抗原表位及HLAⅠ类限制性细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell)表位。方法:采用Ellipro(http://tools.immuneepitope.org/ellipro/)预测Bmi-1蛋白中可能存在的线性B细胞表位和构象B细胞表位;采用Prot Param、Net CTL等软件和方法预测Bmi-1中可能存在的HLAⅠ类限制性CTL表位。结果:Bmi-1蛋白中含有6个线性B细胞表位和8个构象B细胞表位;结合HLA结合力、蛋白酶体切割效率和TAP转运效率,经过Net CTL程序预测表明:针对不同的HLAⅠ类分子,原癌基因Bmi-1中都存在多个HLAⅠ类分子的限制性CTL表位。结论:综合运用多个程序预测了原癌基因Bmi-1中的B细胞抗原表位及HLAⅠ类分子的限制性CTL表位,为下一步开展针对Bmi-1的免疫靶向治疗等研究打下了基础。

中国汉族个体HLAⅠ类基因全长序列鉴定及多态性比较

目的研究中国汉族个体HLAⅠ类基因全长序列多态性及分布特征。方法利用课题组前期已建立的HLAⅠ类基因3.7～4.5kb全长序列的克隆测序方法,从业已进行HLA高分辨测序分型、结果已知的汉族造血干细胞捐献者的血样中,选择45份含HLA-A所有子系等位基因的标本、38份含HLA-B所有子系等位基因,及52份含HLA-C所有子系等位基因的标本进行研究。结果共获得汉族个体HLAⅠ类基因110条全长序列,其中包括HLA-A的38个不同等位基因4.2kb序列,HLA-B的30个不同等位基因3.7kb序列,以及HLA-C的42个不同等位基因4.3～4.5kb序列。

HLAⅠ类分子的缺失与肿瘤逃逸

人类白细胞抗原 (HLA)Ⅰ类分子在肿瘤细胞上的缺失呈异质性 ,现已发现至少有 5种之多 ,并有证据显示这一改变与肿瘤细胞逃避免疫细胞的杀伤、促进肿瘤进展和转移密切相关 ,此外 。

Beclin1和HLAⅠ、Ⅱ在人卵巢癌SKOV3细胞中的表达

目的探讨转染Beclin1质粒的自噬基因Beclin1和免疫应答效应分子HLAⅠ、Ⅱ在人卵巢癌SKOV3细胞中的表达,分析Beclin1在卵巢癌免疫应答中的作用。方法应用基因转染技术、RT-PCR、Western blot法检测Beclin1质粒转染SKOV3细胞前后Beclin1和HLAⅠ、Ⅱ的mRNA和蛋白表达水平的变化。应用免疫荧光显微镜观察Beclin1质粒转染SKOV3细胞后,其自噬小体的变化。用MTT法检测Beclin1质粒转染SKOV3前后细胞的增殖活性。结果 SKOV3细胞转染Beclin1质粒后,Beclin1的转录和翻译水平分别是空载体组的5、2倍。荧光显微镜观察,转染Beclin1质粒组卵巢癌细胞MDC标记的自噬小体数量显著增多。RT-PCR和Western blot结果显示,转染Beclin1可诱导HLAⅠ、Ⅱ等位基因的转录和翻译。Beclin1质粒组的HLAⅠ-A、B、C和HLAⅡ-DP、DQ、DR的mRNA分别是空载体组的2、1.6、3倍和2、6、3倍;其HLAⅠ、Ⅱ的蛋白表达分别是空载体组的2、1.6倍。MTT结果显示,Beclin1质粒组与空载体组、空白对照组相比,在转染24、48、72、96 h后,其细胞生长抑制率分别为42.6%、37.8%、24.35%、14.81%。结论在人卵巢癌SKOV3细胞中,转染外源性Beclin1可诱导细胞自噬并使免疫应答效应分子HLAⅠ、Ⅱ的表达增加。HLAⅠ、Ⅱ表达的增加可能使卵巢癌细胞免疫应答增强。转染外源性Beclin1可抑制卵巢癌SKOV3的细胞增殖。

血液病患者 HLA Ⅰ类抗体筛查预测血小板输注治疗的疗效

目的分析血液病患者HLAⅠ类抗体微珠反应的平均荧光强度(MFI)与血小板输注疗效的关系。方法回顾性分析2021年1月至2022年10月中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)收治的68例血液病患者的临床资料,及血小板输注前HLAⅠ类抗体MFI情况。依据血小板输注后24 h血小板计数增高指数(CCI)判定血小板输注疗效,并将患者分为有效组和无效组,logistic多因素回归模型分析血小板输注效果的影响因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线并计算曲线下面积(AUC)。根据AUC计算约登指数和其最大值,采用ROC曲线分析HLAⅠ类抗体对血小板输注无效(PTR)的预测作用。结果68例患者HLA抗体检测后输注血小板128次,其中有效输注98次,输注有效率76.56%,血小板无效输注30次,PTR发生率23.44%。单因素分析显示有效组和无效组在性别构成、HLAⅠ类抗体阳性占比、HLAⅡ类抗体阳性占比输注前后差值比较,差异有统计学意义(P<0.05);多因素分析显示HLAⅠ类抗体阳性为PTR危险因素(OR=9.64,95%CI:2.73~34.08,P<0.001);Pearson相关性检验得出HLAⅠ类抗体MFI与24 h CCI呈负相关(r=-0.369,P<0.01);根据所建立的预测模型绘制ROC曲线,曲线下面积为0.759(95%CI:0.619~0.898)。通过AUC计算约登指数最大值并得出最大截断值为MFI=531.6,灵敏度为75.00%,特异度为81.25%。结论HLAⅠ类抗体MFI作为预测血小板输注疗效的重要指标,可为临床选择合适血小板输注提供参考。

肿瘤细胞HLAⅠ类分子表达对NK抗性的影响及IFN-γ的调节作用

目的 探讨肿瘤细胞表面HLAⅠ类分子的表达与NK杀伤的关系及IFN γ的调节作用。方法 用间接免疫荧光法检测 7种肿瘤细胞表面HLA ABC分子的表达 ;用鼠抗人HLA ABC单抗封闭靶细胞后 ,观察NK杀伤的变化 ;用IFN γ处理靶细胞后 ,观察瘤细胞表面HLA分子表达的变化及NK杀伤的变化。结果 不同肿瘤细胞株表达HLA ABC分子的比例及荧光强度均不相同 ,除Karpas外 ,均表现为不同程度的下降。HLA ABC表达阴性的K5 6 2细胞对NK杀伤最敏感 ,其他细胞的敏感性均有下降。肿瘤细胞表面HLA ABC分子的表达多有不同程度的下降 ,用抗HLA单抗封闭相应位点后 ,可使NK杀伤明显增强。用IFN γ 5 0 0U/ml处理 48h后 ,白血病细胞K5 6 2、黑色素瘤细胞M2 1和高转移肺癌细胞PG表面HLAⅠ类分子表达明显增加 ,对NK杀伤的敏感性降低 ;而人T细胞淋巴瘤Karpas、髓样白血病细胞HL6 0和结直肠癌细胞HT2 9经处理后 ,HLAⅠ类分子表达无明显变化 ,对NK杀伤的敏感性反而明显增强。IFN γ促进HL6 0和HT2 9细胞的凋亡。结论 NK细胞能识别HLA ABC分子表达下降或缺陷的肿瘤细胞并发挥杀伤作用 ;IFN γ能恢复部分肿瘤细胞HLA ABC分子的丢失 ,并能促进部分肿瘤细胞的凋亡 ,提高肿瘤对机体抗瘤机制的敏感性。

广东汉族人群HLAⅠ、Ⅱ基因多态性及单倍型分析

目的检测广东汉族人群HLAA、B、Cw、DRB1基因频率,分析该人群HLAⅠ、Ⅱ等位基因多态性及其单倍型特点。方法骨髓移植供者160人,抗凝血提取DNA,半量全自动聚合酶链反应单链构象多态分型检测HLAA、B、Cw、DRB1基因型。结果在低分辨水平分别检出HLAA、B、Cw及DRB1等位基因12、23、11、13个。统计分析呈现显著连锁不平衡的HLAAB单倍型9个,BCw单倍型20个,ACw单倍型7个,HLAADRB1单倍型8个,BDRB1单倍型9个,CwDRB1单倍型10个。结论广东汉族群体HLA基因具有较为丰富的多态性,其双座位连锁不平衡单倍型具有地区性遗传特征。

卵巢癌细胞HLA Ⅰ类分子表达异常和TAP,LMP基因表达的关系

目的:肿瘤细胞表达MHCⅠ类分子是激发肿瘤抗原特异性CTL进行肿瘤免疫治疗的关键,肿瘤细胞HLAⅠ类分子表达异常是肿瘤逃脱免疫监视的重要机制.我们探讨了卵巢癌细胞HLAⅠ类分子表达异常的分子基础.方法:本文以West-ern blot、免疫组化和流式细胞术检测卵巢癌细胞HLA Ⅰ类分子的表达,以RT-PCR检测TAP,IMP基因的表达,探讨肿瘤细胞HLA Ⅰ类分子表达异常的分子基础.结果:卵巢癌中HLA Ⅰ类分子表达异常相当普遍(5/8),并涉及抗原加工相关基因TAP,LMP基因表达异常.25℃培养肿瘤细胞可部分诱导Ⅰ类分子的表达;结论:卵巢癌HLA Ⅰ类分子表达异常与其Ⅰ类抗原加工途径异常有关.

用竞争结合法检测HLAⅠ类分子抗原呈递能力

目的 建立弱酸处理后荧光素标记肽竞争结合法分析MHCⅠ类分子抗原呈递能力的方法 ,并评估其实用性。方法 pH2 .7～ 3.1的柠檬酸缓冲液对B淋巴母细胞进行短时处理后 ,即用IMDM培养液中和pH ,然后加入β2微球蛋白、荧光素标记的 9肽及竞争肽共同孵育 ,FACs检测细胞表面的平均荧光强度 ,以达到 5 0 %抑制所需的竞争肽浓度作为衡量竞争肽与MHC分子结合能力的指标。结果 通过不同pH的柠檬酸缓冲液处理、处理后不同时间加 β2微球蛋白和 /或荧光素标记肽、加入不同稀释度的竞争肽等角度 ,对方法进行评估 ,结果显示本方法操作简便、结果可靠、非特异性吸附小。结论 在排除其它MHCⅠ类分子的干扰后 ,本方法适合在国情条件下广泛开展MHCⅠ类分子抗原呈递能力及T细胞肽表位筛选等研究。

HLAⅠ、Ⅱ类抗原的组织配型基因芯片的建立及应用

目的应用基因芯片技术进行北方汉族人群HLAⅠ、Ⅱ类抗原中分辨度分型研究，建立稳定的HLA检测芯片。方法采用寡核苷酸芯片分型方法，选择了中国人群基因频率较高的等位基因，同时考虑遗传的连锁不平衡，根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB、HLA-DQA不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，共设计了213条探针（HLA-A56条，HLA-B66条，HLA-DQA22条，HLA-DQB38条，HLA-DR31条）制成基因分型芯片。采用带荧光标记的引物，用合适的PCR方法扩增HLAⅠ、Ⅱ类抗原上的多态性区域，产物与芯片上探针杂交。杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断，以此确定样品基因型。结果所有样本的HLAⅠ、Ⅱ类抗原基因分型均获成功。此中分辨度探针可分出598个Ⅰ类抗原等位基因，511个Ⅰ类抗原等位基因，可捡出Ⅰ类抗原特异性57个，Ⅱ类抗原特异性30个。结论基因芯片用于HLAⅠ、Ⅱ类抗原分型可行。其分辨率高、特异性强，可用于HLA基因分型、骨髓移植、器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗传性疾病的人群筛查。

HLAⅠ、Ⅱ类基因与肾综合征出血热重型与轻型的相关性研究

目的探讨HLAⅠ、Ⅱ类基因多态性与肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syn- drome,HFRS)患者临床特征的相关性。方法应用PCR-SSO(polymerase chain reaction using sequence- specific oligonucleotides)基因分型技术对中国北方地区56例汉族HFRS患者HLAⅠ、Ⅱ类基因频率分布进行了检测。结果HFRS重型组HLA-B35携带率为20％,HLA-B62及HLA-DR11携带率皆为15％,与轻型组比较差异皆具有统计学意义(P<0．05)。结论HLAⅠ类基因中HLA-B35、HLA-B62及HLAⅡ类基因中HLA-DR11与中国北方地区汉族人群HFRS患者病情严重性密切相关。

小儿肾病综合征与HLAⅠ、Ⅱ类基因相关性的研究

小儿原发性肾病综合征（PNS）病因尚未明确，多数学者认为与免疫、遗传有关。人白细胞抗原（HIJA）是人类主要遗传免疫标志之一，HIJA与小儿PNS的关系各国报道不一，主要集中于A、B、DR、DQ位点。我们采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术（PCR-SSP）检测山西汉族激素敏感型肾病综合征（SSNS）患儿HLA-A、B、DRB1位点等位基因的表达。

HLAⅠ类抗原的基因芯片分型技术研究

目的 采用DNA芯片技术进行汉族人群HLAⅠ类抗原A、B位点的DNA分型研究 ,并实现将A、B位点的DNA分型集中于一张芯片上 ,同时完成。方法 根据HLAⅠ类抗原A、B位点不同基因亚型的独特序列设计探针 ,制成分型芯片 ;待检测样品经PCR反应标记上荧光之后 ,与探针在芯片上进行杂交 ,通过对杂交产生的荧光信号值进行分析 ,确定样品的HLA A、B基因亚型。将这一方法应用于 2 2 0份样本的HLAⅠ类DNA分型并将部分样品进行基因测序。结果 所有样本的HLAⅠ类基因芯片分型均获得成功 ,无假阳性和假阴性出现 ,80份样本的重复率为 10 0 % ,总耗时 2 .5h。分型结果经双盲验证完全符合。可准确分辨出A位点等位基因 2 0个 ,B位点等位基因 4 1个 ,实际检出汉族人群A抗原特异性 13个、B抗原特异性 32个。结论 基因芯片用于HLAⅠ类A、B分型技术可行 ,其分辨率高、特异性强、重复性好、操作简便快速、结果直观 ,可以在一张芯片上同时检测HLA A、B位点 ,并实现一张芯片多人份 ,适合于临床应用。

TAP和HLA-Ⅰ类抗原在人肝细胞癌中的表达

为探明肝细胞癌 (HCC)组织中抗原Ⅰ类递呈途径的存在状况 ,采用免疫组织化学技术对 3 0例HCC和2 8例癌旁组织中TAP与HLA -Ⅰ类抗原的表达进行了检测。结果显示 ,HCC和癌旁组织基本上都有较强的TAP和HLA -Ⅰ类抗原的表达 ,两者无明显差异 (x2 <0 0 2 ,P >0 0 5 ) ,这表明HCC中抗原Ⅰ类递呈途径可能基本正常 ,胞毒性T细胞 (CTL)能够杀伤HCC细胞 。

胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类分子表达降低的机制研究

目的:探讨胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类抗原表达水平异常的分子机制。方法:以胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901为对照,利用流式细胞仪检测细胞表面HLA-Ⅰ类复合物的表达情况,W estern b lot检测HLA-Ⅰ类分子重链及轻链表达情况,半定量RT-PCR检测HLA-Ⅰ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况,并利用HLA基因区域的微卫星序列检测MKN细胞HLA基因在DNA水平的完整性。结果:胃癌细胞系MKN表面HLA-Ⅰ类复合物表达降低,重链A及B/C位点蛋白无表达而轻链表达无异常。在mRNA水平,胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失。微卫星DNA扩增结果初步显示,MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失。结论:胃癌细胞系MKN HLA-Ⅰ类分子复合物表达降低可能是由HLA-Ⅰ类分子重链及其加工分子在转录水平改变而引起的。