基因组DNA高通量提取技术及其在骨髓库捐献者样本HLA基因分型中的应用

本研究旨在建立从全血EDTA抗凝样本中高通量提取基因组DNA的有效方法,以常规应用于Luminexr SSO HLA流式磁珠基因分型。使用2ml深孔板和TECAN DNA全自动工作站,从288份骨髓捐献者样本中提取基因组DNA;提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性;DNA样本用Onelambdar SSOHLA-A、B和DRB1基因分型试剂盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测,统计分析每一DNA样本HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经DNA探针分子杂交后的阳性磁珠和阴性磁珠的荧光信号强度。结果表明:从400μl全血中提取了基因组DNA,288份样本的DNA产量平均为3.217±0.715μg,A260/A280值平均为1.710±0.103,A260-A320/A280-A320值平均为1.761±0.151;用琼脂糖凝胶电泳法测得DNA的分子量均大于15kb;每一样本HLA-A、-B和-DRB1杂交后的阳性磁珠的荧光信号强度均>600RFU,而阴性磁珠的荧光信号强度<50RFU。结论:本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得的基因组DNA适用于高通量中华骨髓捐献者样本的HLA流式磁珠基因分型等下游的移植免疫学与分子生物学实验。

改良盐酸胍法提取脐血DNA用于HLA基因分型

为了比较经典的盐酸胍(Gu·HCl)抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法在提取脐血DNA的效果,探讨这两种方法在脐血组织相溶性抗原(HLA)基因分型中的应用,使用盐酸胍抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法提取72例脐血标本的DNA,并分别测定其DNA的浓度和纯度,采用序列特异性引物聚合酶反应方法(PCR-SSP)比较这两种方法所提取的DNA。结果表明:两种方法提取脐血DNA均获成功;根据对DNA的质量监测发现,用改良盐酸胍抽提DNA在质量上较盐酸胍法好;用于HLA基因分型时,改良盐酸胍抽提DNA法可减少非特异性条带的出现。结论:改良盐酸胍抽提DNA法不但操作简便,成本下降,而且在最少血量中能提取出高纯度的DNA,减少非特异性条带的出现。该法完全可以满足脐血库的日常脐血样品DNA的提取以及脐血HLA基因分型的要求。

HLA基因分型技术的进展与展望

研究人的主要组织相容性复合物HLA(humanleucocyteantigen,人类白细胞抗原)的结构和功能有助于认识生命现象的本质以及疾病的致病机理,因此长期以来一直是生命科学研究的重点之一。随着分子生物学技术的迅速发展,HLA分型已经由传统的血清学水平向DNA水平过渡,并取得了很好的效果。本文对目前各种HLA基因分型方法的原理和优缺点结合自己的应用经验做了评价,并简要介绍了在HLA基因分型研究中出现的新的动态。

聚合酶链反应-反向杂交流式分析技术在骨髓库HLA基因分型中的应用

目的 了解河南省汉族人群HLA A、B、DRB1基因多态性。评价流式反向SS0技术在骨髓库大量样本检测中的应用效果。方法 用Luminex开发的反向SS0方法对 2 2 0 0名造血干细胞捐献者进行HLA A、B、DRB1基因分型 ,观察基因的分布情况 ,计算基因频率 ,并与不同地区不同种族人群进行比较。结果 HLA A位点检出 18个基因型别 ,基因频率较高的有A2、A11、A2 4、A33。HLA B位点检出 4 1个基因型别 ,基因频率较高的有B13、B5 1、B4 6、B4 0、B35、B15。HLA—DRBl位点检出 13个基因型别 ,基因频率较高的有DRB10 7、DRB10 4、DRB10 9、DRB112、DRB10 5。结论 我省汉族人群HLA基因呈高度的多态性 ,分布及基因频率与国外有非常显著的差异 ,与我国南方地区汉族有显著差异 ,与北方人群相近。LuminexSS0方法用于大量样本的HLA检测较PCR—SSP简便、节省人力。

应用PCR-SSOP技术进行大样本脐血HLA基因分型的探讨

目的:探讨一种高效、快速、准确、省力并能批量检测HLA基因分型的方法。方法:采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)反向杂交技术对天津地区汉族健康新生儿脐血HLA-A、B、DR位点进行中低分辨基因分型。结果:共检出72种HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗原,其中A位点抗原检出19种;B位点抗原检出40种;DR位点抗原检出13种。结论:PCR-SSOP是一种结果相对准确稳定、操作简便快速、适用于脐血库等进行大样本分型检测HLA多态性的分子生物学技术。

脐带血HLA基因分型质评结果分析

目的探讨建立进行常规HLA基因分型质量监控的标准,减少分型错误率,为临床提供准确、可靠的HLA基因分型结果。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物扩增(PCR-SSP)方法、直接测序分型穴SBT雪方法,随机抽查天津市脐带血造血干细胞库脐带血及查询已选中做脐带血移植的样本共88例SSOP方法的结果进行HLA基因分型复核。结果复核结果表明,本实验室HLA基因分型错误率低于3%[1],分型重复率达到97%,符合美国“国家骨髓供者登记(NMDP)”提供的标准。结论以不同基因分型方法评估本实验室HLA基因分型结果完成情况,可保障分型结果的精确度和可靠性,减少分型错误率,提高脐带血移植成活率。

基因芯片在个体化医疗的实际应用 博奥生物的HLA基因分型技术服务介绍

人的所有特征和疾病几乎都与人的基因组相关，在人类个体之间，约有四千分之一的DNA序列不同．这些不同导致了人们对许多疾病易感性的不同，也影响了个体对同一治疗的反应不同。HLA是Human Leukocyte Antigen的缩写，即人类白细胞抗原．存在于人体的各种有核细胞表面，在不同种族、不同个体间呈现高度多态性，是人体生物学的“身份证”，由父母遗传人类白细胞抗原（HLA）是临床医学中常见的DNA序列差异而导致对疾病易患性不同的例子．

改良离心吸附柱法提取全血DNA在HLA基因分型中的应用

目的:采用改良离心吸附柱法提取人类基因组DNA,能较快、地更好地适用于HLA高分辨基因分型。方法:170份EDTA2K2抗凝全血标本中90份标本采用改良离心吸附柱法、另外80份采用未改良离心吸附柱法提取DNA,用PCR-SSO方法做HLA-A、B、DR三个位点的基因高分辨分型。然后就所获DNA浓度和纯度、操作时间、分型结果4个方面进行统计学分析。结果:改良前后提取的DNA平均含量和纯度差异有统计学意义;整个操作时间改良后时间明显缩短;170份全血标本的DNA经扩增杂交后都能有较好的基因分型结果。结论:采用改良离心吸附柱法提取人类白细胞DNA,操作简单、快速省时、效率高。方法稳定、可靠,无一例失败,能缩短我们的DNA提取时间,有利于提高我们的工作效率,更好的适用于HLA基因分型。

人类白细胞抗原基因分型与微珠反应格局

背景:Flow-rSSO结合流式细胞分析技术和PCR-SSO技术的高通量分型方法,是目前国外人类白细胞抗原分型中应用最多的方法。目的:筛选同组不同等位基因之间的微珠反应格局,加强人类白细胞抗原基因分型方法的标准化,使分型向最快最准确的方向发展。方法:使用TECAN DNA全自动工作站从457份中华骨髓库捐献者全血样本中提取基因组DNA,DNA样本用One Lambda rSSO HLA-A、B和DRB1基因分型高分试剂盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测。参考One Lambda公司提供等位基因微珠格局表(HLA-A,Band DRB1)分析常见等位基因,并对常见等位基因与微珠的相关性进行研究。结果与结论:同一组常见等位基因除相同微珠反应格局外,与某个或某几个有区别的微珠是密切相关的。就临床组织器官移植而言,采用中分辨度DNA分型技术是最佳选择,一方面有利于快速筛选,另一方面能够降低匹配难度。就科研工作而言,一般采用高分辨率分型方法。

人类白细胞抗原基因分型检测试剂盒行业标准的修订与验证

目的对2010年发布的YY/T 1180-2010《人类白细胞抗原(HLA)基因分型试剂盒(SSP法)》进行修订并验证。方法按照拟定行业标准的要求,选择不同方法学的人类白细胞抗原(HLA)基因分型试剂盒进行验证。结果外观、参考品符合率、重复性、有效检测范围、检出限、稳定性等性能指标符合要求。结论人类白细胞抗原(HLA)基因分型试剂盒行业标准的修订及时科学合理,适用范围更加全面,有助于规范此类试剂盒的技术要求和检验方法,从而提高此类试剂盒的产品质量,并为其上市前后的监管提供依据。

人白细胞抗原一DPB1基因直接测序分型技术

研究建立准确的基于人白细胞抗原一ＤＰＢ１（ＨＬＡ－ＤＰＢ１）核酸序列的基因分型技术，为疾病与ＨＬＡ基因相关性研究及器官、组织移植提供准确的ＨＬＡ基因分型方法。使用第十一届国际组织相容性会议提供的引物，经ＰＣＲ技术扩增、分离相应的基因片段，纯化后用ＰＥ公司四色荧光染料终止剂标记循环测序技术直接测定核酸序列，获得个体基因型序列资料，通过与基同型资料数据库比较确定基因型别。这一技术可以准确地确定个体的 ＨＬＡ－ＤＰＢ１的基因型别并得到核酸序列。为进一步研究奠定了基础。本技术可用于其它类似的研究工作。

供、患者HLA-A、B、DRB1高分辨分型的无关供者外周血造血干细胞移植32例回顾分析

目的探讨供、患者的人类白细胞抗原HLA-A、B、DRB1基因高分辨相合及亚型相合,无关供者外周血造血干细胞移植后效果的情况,为临床造血干细胞移植治疗选择适配供者提供理论依据。方法采用PCR-SSP或SBT技术对供、患者HLA-A、B、DRB1的基因进行高分辨分型,定期随访患者在造血干细胞移植后状况,统计分析移植后效果。结果32例患者与供者的HLA低分辨分型结果完全相合,HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型全相合的患者与HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型不相合的患者,造血干细胞植活和两年半内的移植存活率比较,无统计学差异。结论HLA低分辨分型结果完全相合是临床医生选择造血干细胞移植的重要条件之一,供、患者HLA-A、B、DRB1高分辨分型是外周血造血干细胞移植治疗前组织配型不可少的实验之一,但HLA-A、B、DRB1基因高分辨分型错配对无关供者外周血造血干细胞移植的造血干细胞植活和两年半内的移植存活率影响较小,HLA基因高分辨分型可以帮助临床医生选择合适的供者。

无限增殖化人类B淋巴细胞基因组DNA提取方法的建立

目的建立从无限增殖化人类B淋巴细胞提取基因组DNA的方法,并评价提取DNA的质量和产量.方法用DNA提取试剂盒提取基因组DNA;用紫外分光光度法测定DNA样本的纯度和产量;用琼脂糖电泳法测定DNA样本的完整性.结果 （1～2）×10^7个B淋巴细胞提取基因组DNA的平均浓度为174±61.3 ng/μl,DNA的纯度平均为1.73±0.047（A260nm/A280nm）,琼脂糖电泳测得DNA分子量约为21 kb,且无污染.结论该方法可以从无限增殖化人类B淋巴细胞提取高质量高浓度的基因组DNA.

器官移植前HLA-A-B-DRDNA样本的制备

随着分子生物学技术的飞速发展,HLA基因分型在临床上及许许多多学科有着重要地位.DNA的提纯与纯化一直是耗时繁锁的过程,DNA质量与数量直接影响HLA分型,从微量血中制备高质量的DNA样品是器官移植前HLA-A-B-DR-PCR-SSP的分型关键.这在移植、诊断、法医学及科学研究中起到重要作用.