HLA-A^＊2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24+供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8+T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。

负载野生型p53抗原肽HLA-A^＊2402四聚体的制备和鉴定

目的:制备负载野生型p53抗原肽的HLA-A*2402四聚体,用于检测卵巢肿瘤患者p53特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。方法:在p53125-134抗原肽TYS和轻链β2微球蛋白存在时,利用稀释法复性获得负载p53125-134抗原肽(TYSPALNKMF,TYS)的可溶性单体,经生物素酰化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4∶1的比例混合形成HLA-A*2402/TYS四聚体,以流式细胞仪检测特异性CTL的频率。结果:流式细胞术分析显示,卵巢癌患者外周血中可检测减低频率的p53125-134TYS抗原肽特异性CTL。结论:成功制备HLA-A*2402/TYS四聚体。

负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽HLA-A^＊2402四聚体制备及鉴定

目的:构建负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽的HLA-A*2402四聚体并进行鉴定,为分析gp100抗原肽诱发的特异性细胞免疫应答创造条件。方法:以羧基端融合生物素化酶BirA底物肽的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白、人β2-微球蛋白、gp100 VYFFLPDHL抗原肽、PE-链亲和素为材料,制备HLA-A*2402/VYF四聚体;非还原SDS-PAGE鉴定四聚体四聚化程度;三色免疫荧光标记流式细胞术分析HLA-A*2402+健康志愿者外周血gp100特异性CD8+T细胞的频率。结果:HLA-A*2402/VYF四聚体形成率为83%,所制备的四聚体具有与HLA-A*2402+供者抗原特异性CD8+T细胞的结合活性,特异性CD8+T细胞的频率为外周血总CD8+T细胞的0.02%～0.06%。结论:成功制备HLA-A*2402/VYF四聚体并用于检测gp100特异性CD8+T细胞,为研究HLA-A*2402+黑素瘤患者免疫治疗的机制及疗效监测创造了条件。

新型冠状病毒肺炎康复个体HLA-A^(*)02限制性CD8^(+)T细胞免疫应答研究

目的 研究严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染个体康复4~5个月后外周血中HLA-A^(*)02限制性SARS-CoV-2表位特异性CD8^(+)T细胞应答水平及规律。方法 本研究在以往鉴定获得SARS-CoV-2刺突蛋白来源HLA-A^(*)0201限制性CD8^(+)T细胞9肽表位ALNTLVKQL和YLQPRTFLL的基础上,应用流式细胞术筛选入组HLA-A^(*)02阳性SARS-CoV-2灭活疫苗接种后感染且康复4~5个月后个体共27例,构建HLA-A^(*)02/9肽四聚体,分别应用酶联免疫斑点实验、四聚体(tetramer)染色技术及胞内细胞因子染色等方法,对康复个体外周血中SARS-CoV-2表位特异性的功能性CD8^(+)T细胞频率、表型以及分泌细胞因子和杀伤介质的能力进行检测。结果 HLA-A^(*)02^(+)康复个体外周血中可分别检测到分泌IFN-γ的SARS-CoV-2 9肽表位ALNTLVKQL和YLQPRTFLL特异性CD8^(+)T细胞应答,且tetramer^(+)CD8^(+)T细胞频率仍维持较高水平。表位特异性CD8^(+)T细胞主要表现为CCR7-CD45RA-效应记忆表型和CD27-CD28-高分化表型,可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等多种细胞因子,以及颗粒酶B和穿孔素杀伤介质。结论 SARS-CoV-2感染康复后外周血中存在着HLA-A^(*)02限制性SARS-CoV-2表位特异性CD8^(+)T细胞应答,且其应答频率可至少持续至康复后4~5个月,仍具有抗病毒的功能和效应。

HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的:构建2种HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物四聚体,并初步用该2种四聚体检测针对不同抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)。方法:原核高效表达HLA-A*2402-BSP和β2m蛋白后,分别与乙型肝炎病毒抗原肽Pol756-764和Core117-125在体外复性折叠成可溶性的HLA-A*2402抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成2种HBV抗原肽四聚体。最后进行流式细胞术检测。结果:Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了2种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*2402复合物单体。结论:构建的2种四聚体可以检测乙型肝炎感染者体内特异性的CTL。

生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备

目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。

sHLA-A*2402融合蛋白的制备与特性研究

本文用含有HLA-A*2402重链胞外段基因的质粒为模板进行PCR,利用下游引物拼接上依赖BirA的可生物化序列后,构建融合基因sHLA-A*2402-BSP,与质粒pET-21d重组后,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达的融合蛋白与β2m及HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行复性折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并用Westernblot和夹心ELISA法鉴定。证实成功地制备出sHLA-A*2402-生物素化序列融合蛋白并使之正确折叠复性。为研究在原核系统中表达、纯化与复性及体外构建MHCI类分子四聚体,探讨免疫识别机制奠定了基础。

丙型肝炎病毒HLA-A*1101和A*2402限制性CD8^+T细胞表位的研究

目的:鉴定出丙型肝炎病毒(HCV)特异性HLA-A*1101限制性和A*2402限制性CD8+T细胞表位。方法:采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8+T细胞表位,合成HLA-A*1101限制性、A*2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A*1101阳性、A*2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A*1101或A*2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A*1101阳性或A*2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞(PBMCs)后,采用酶联免疫斑点(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICS)实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素(IFN-γ)的细胞的水平和肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞的水平。结果:5条HLA-A*1101限制性候选表位中,NS3_609(ITLTHPITK)和NS2_165(VVFSDMETK)与HLA-A*1101分子具有高结合力。3条HLA-A*2402限制性候选表位中,NS3_373(KCDELASKL)和NS5b_382(YYLTRDPTI)与HLA-A*2402具有高结合力;在HLA-A*1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞,而在HLA-A*2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b_382特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞。结论:本研究证实NS3_609(ITLTHPITK)和NS2_165(VVFSDMETK)为全新的HCV特异性HLA-A*1101限制性CD8+T细胞表位,NS3_373(KCDELASKL)和NS5b_382(YYLTRDPTI)为全新的HCV特异性HLA-A*2402限制性CD8+T细胞表位。

中国西北汉族人群HLA-A^＊02等位基因的分布特点

目的研究西北汉族人群HLA-A* 02等位基因的分布特点。方法对760份健康无血缘关系的西北汉族人群HLA-A* 02等位基因进行高分辨基因分型,计算HLA-A* 02各等位基因构成比并与其他不同地区人群进行比较。结果 760份样本中,检出9种HLA-A* 02等位基因,以A* 0201(48.86%)为优势等位基因,A* 0207(22.72%)和A* 0206(15.91%)比较常见,纯合子主要为A* 0201/A* 0201,杂合子主要为A* 0201/A* 0207。结论西北汉族人群HLA-A*02等位基因的分布特点比较接近北方汉族人群,但具有其自身分布特点。

可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化

目的研究可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法将原核高效表达的可溶性HLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白(β2m)与HLA-A*2402限制性抗原肽Epstein-Barr病毒(EBV)即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠,形成HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体,并在BirA酶的作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-pBRLF1复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗(W6/32和兔抗人β2m抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA-A*2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞(aAPCs)诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA-A*2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA-A*2402-pBRLF1四聚体。结论HLA-A*2402-pBRLF1四聚体构建成功,为特异性CTL的检测提供了有力的工具。

宁波地区癫痫患者抗癫痫药物治疗中出现的皮疹与HLA-B^*1502、HLA-A^*3101基因的关系

目的探讨宁波地区HLA-B^*1502、HLA-A^*3101基因对抗癫痫药物奥卡西平(OXC)及卡马西平(CBZ)与皮疹发生的相关性。方法纳入103例局灶性癫痫患者,根据药物治疗所致皮肤不良反应(c ADRs)分为StevensJohnson综合征(SJS)组、多形性红斑(MPE)组和药物耐受组,检测3组HLA-B^*1502、HLA-A^*3101基因。结果7例患者出现SJS,其中HLA-B^*1502阳性5例,HLA-A^*3101阳性1例,HLA-B^*1511阳性1例。9例患者出现MPE,其中HLA-B^*1502阳性1例,HLA-A^*3101阳性3例。87例耐受者中HLA-B^*1502阳性5例,HLA-A^*3101阳性3例。SJS组HLA-B^*1502阳性率高于其余两组(均P<0.05),MPE组HLA-A^*3101阳性率高于药物耐受组(P<0.05)。结论宁波地区OXC或CBZ所致SJS与HLA-B^*1502密切相关,与HLA-A^*3101无明显相关;OXC或CBZ所致MPE与HLA-B^*1502无明显相关性,而与HLA-A^*3101相关。临床用药前完善基因检测是必要的,可减少严重皮疹的发生。

BPSK调制芯片——MAX2402

MA×2402是美国MA×IM公司为射频段BPSK调制设计的集成电路。本文介绍了它的内部结构和工作原理,最后给出了其典型应用电路图。

扩频通信发送器集成电路MAX2402

一、引言目前,在无线局域网中,大多采用无线扩频技术。扩频技术常用的三个频段是L频段(902～928MHz)、S频段(2.4～2.4835GHz)和C频段(5.725～5.825GHz),上述三个频段合在一起构成了所谓ISM(工业、科学、医疗)频段。在美国,ISM频段是开放的频段,对大多数国家,ISM也是不受管制的频段,因而使用方便。在IEEE802.11协议中,指定的是S频段,因为这一频段目前全世界都未加以规定。扩频设备可分为两类:直接序列扩频(Direct Sequence Spread Spectrum)和跳频扩频(Frequency-Hopping Spread Spectrum)。直接序列扩频方式(简称DS方式)更为普遍,它可同时在同一频段通过几个频率发送数据。跳频扩频采取不同的策略,它在信号传输过程中快速的改变频率。

基于MSP430F2001和nRF2402的主动式电子标签设计

介绍了基于MSP430F2001微控制器和nRF2A02射频芯片的主动式电子标签的构成,并对主动式电子标签的软硬件设计进行了较为详细的介绍。软件系统采用嵌入式操作系统μC/OS-Ⅱ,以增加系统的实时性和可靠性。

一坪牌SH 2402号重负荷开式齿轮脂

一坪牌SH2402号重负荷开式齿轮脂(简称SH 2402号脂)是由皂类稠化剂稠化高粘度基础油,并加有极细的固体润滑剂、极压抗磨、抗氧、防腐、防锈等添加剂而制成。本产品具有良好的抗磨极压性。

中国南北汉族人群HLA-A*02等位基因的分布差异

目的研究中国南北汉族人群中HLA-A*02等位基因的分布并比较其差异性。方法采用PCR-SBT方法,对随机抽取的经PCR-SSP方法确认为HLA-A*02阳性的208例南方和129例北方汉族骨髓志愿供者进行序列分型。结果南、北汉族人两个群体中均检出具有不同基因频率的6种A*02等位基因(A*020101、A*0203、A*0205、A*0206、A*0207和A*0210)。南方汉族人中A*0207(37%)为优势等位基因,A*020101(31%)、A*0203(16%)和A*0206(14%)比较常见;而北方汉族人则以A*020101(48%)为优势等位基因,A*0206(21%)和A*0207(23%)比较常见。两个群体中的A*02等位基因总体分布以及A*020101、A*0203和A*0207的相对频率均存在显著性差异。在高、低分辨率两个水平上,南方和北方汉族A*02杂合度分别高于90%和80%,并且低分辨率A*02纯合子在高分辨率水平上表现高度多样性并呈现一定的分布规律。结论HLA-A*02等位基因在中国南、北汉族人群中的分布呈现高度杂合和遗传多样性并具有显著性差异,HLA-A*020101、A*0203和A*0207可作为人类学研究中区分中国南北汉族人群的遗传标志。

用细胞内细胞因子染色方法检测HLA-A~*02个体CD8^+T细胞的免疫应答

目的 :用细胞内细胞因子染色方法 (ICCS)检测不同HLA A 0 2个体的CD8+ T细胞对流感病毒多肽的免疫应答状况。方法 :采用SSP法确定HLA A 0 2亚型 ;分离HLA A 0 2个体的外周血单个核细胞 (PBMC) ,与流感病毒特异的HLA A 0 2 0 1限制性CTL表位多肽 (IMP5 8 6 6 ,GILGFVFTL)孵育 ,ICCS检测CD8+ T细胞分泌细胞因子IFN γ、IL 2和TNF α。结果 :发现HLA A 0 2不同亚型的人PBMC对流感病毒多肽均具有记忆性免疫应答。结论 :①ICCS方法可特异性定量检测T细胞活化状态 ;②HLA A 0 2人群中普遍存在对IMP5 8 6 6多肽的记忆性免疫应答 ;③对于HLA A 0 2 0 1限制性多肽 ,与其它不同HLA A 0 2亚型间存在交叉反应性。

一个新的等位基因：HLA—A^＊1114克隆和序列分析

目的 识别确认中国人群的HLA新等位基因。方法 使用PCR SSP以及以测序为基础的分型 (SBT)技术 ,在HLA分型常规工作中发现 1个与HLA A 110 2基因相关的新基因 ,以基因克隆及DNA测序 ,分析该基因和A 110 2基因序列的差异。结果 该基因和A 110 2基因序列的差异在于外显子 3区域中 ,5 2 4A >G ,5 2 6G>C以及 5 2 7C >G等 3个碱基的取代 ,使密码子 175由组氨酸变为精氨酸 ,密码子 176由丙氨酸变为精氨酸。结论该基因为HLA新等位基因 ,2 0 0 2年 9月已被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA A 1114。用PCR SSP方法 ,在 30 0 0名随机造血干细胞供者中 ,未发现其他带有A 1114基因的个体。