PCR-SBT检测HLA-C座位1-7外显子序列鉴别HLA-C＊07：01：01G和C＊07：02：01G组等位基因

本研究旨在探讨区分人类白细胞抗原(HLA)-C*07:01:01G和HLA-C*07:02:01G组内等位基因,并分析其与HLA-B的连锁情况。通过收集HLA-C*07:01:01G组和HLA-C*07:02:01G组标本,采用聚合酶链反应测序分析方法(PCR-SBT)检测HLA-C座位第1-7外显子编码序列,并采用PCR-SBT方法对标本进行HLA-B基因分型。结果表明,13例HLA-C*07:01:01G组标本中,4例(30.8%)标本为HLA-C*07:01:01,9例(69.2%)标本为HLA-C*07:06;连锁分析显示,HLA-C*07:06与HLA-B*44:03高度连锁。102例HLA-C*07:02:01G组标本全部为HLA-C*07:02:01;连锁分析显示,HLA-C*07:02:01与HLA-B*51:01、B*46:01、B*39:01、B*40:01、B*38:02、B*15:02高度连锁。结论:HLA-C*07:01:01G组中发现存在HLA-C*07:01:01和HLA-C*07:06,而HLA-C*07:02:01G组中以HLA-C*07:02:01为主导。

胎儿微嵌合细胞及抗原通过外泌体途径调节HLA-C影响复发性流产

复发性流产作为妇产及生殖领域一疑难病症,主要表现为2次及以上的自然流产,其发病机制广泛而复杂。主要涉及染色体、母胎免疫等各方面原因。胚胎作为一种半同种异体移植物,其自身细胞及抗原可通过胎盘循环进入母体进而调节母体的免疫功能。外泌体作为一种直径在40~160 nm之间的囊泡,可作为运输载体包裹蛋白、非编码RNA等多种物质来实现细胞间的信号传导及物质传递。母体与胚胎免疫识别依靠HLA家族的不同亚型来实现,而HLA-C是唯一可在滋养细胞表面表达的MHC I类分子,其可作为杀伤细胞免疫球蛋白样受体的配体发挥免疫调节作用。综上所述,胎儿微嵌合细胞及抗原可通过外泌体途径调节HLA-C影响复发性流产的产生及进展。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其配体HLA-C基因多态性与不明原因早期复发性流产的相关性

目的:探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其配体HLA-C基因多态性与不明原因早期复发性流产易感性的关系。方法:留取不明原因早期复发性流产患者(38例,URSA组)及正常早孕妇女(35例,对照组)的蜕膜、绒毛组织,抽提基因组DNA,序列特异性引物聚合酶链反应检测蜕膜组织14种KIR基因的表达;DNA测序法分析绒毛滋养细胞HLA-C1、HLA-C2基因多态性。结果:14种KIR基因均以不同频率表达;KIR2DS1基因的频率在URSA组与对照组中分别为60.27%vs41.18%,两组相比,差异有显著性(P=0.03)。两组基因HLA-C1、HLA-C2在绒毛组织中呈不平衡表达,以HLA-C1基因占明显优势。URSA组与对照组HLA-C1基因频率分别为66.67%、81.03%,两组相比差异无显著性,P=0.657;URSA组HLA-C2的基因频率为33.33%,对照组HLA-C2的基因频率为19.07%,两组相比差异有显著性,P=0.007。结论:蜕膜NK细胞活化性KIR基因频率升高,与绒毛滋养细胞的HLA-C2基因结合,传递活化性信号活化NK细胞,可能是引起URSA发病的免疫遗传学因素之一。

直接测序法用于四川骨髓库汉族人群HLA-C等位基因分布的研究

目的建立HLA-C等位基因通用引物直接测序法,研究中华骨髓库四川分库(简称四川骨髓库)中川籍汉族人群HLA-C等位基因分布。方法在四川骨髓库已获HLA-A/B/DRB1高分辨分型结果的600余份川籍汉族街头无关自愿捐献者标本中,随机选择244份标本,采用PCR-SBT对HLA-C位点测序分型,通用引物测序后产生的模棱两可分型结果,分别采用加测相应外显子和组特异性测序方法确认;获得所有标本确切的高分结果后,计算HLA-C各等位基因分布频率,并与其他人群比较。结果 244份标本中直接出HLA-C位点高分辨结果的比例为27.87%(68/244),须加测外显子1、5、6和7的为61.07%(149/244),须组特异性测序的为47.54%(116/244);共检出HLA-C等位基因25个,其中等位基因频率>10%的3个:C*01∶02、C*07∶02和C*03∶04,等位基因频率>1%的12个,累计频率95.69%;四川汉族人群HLA-C等位基因的分布与中国南方人群最为接近,与美国高加索人群和黑人的差异最大。另外,发现了1例新等位基因C*06∶45,它与同源性最高的C*06∶02在第187位碱基存在1个点突变:G>T,使密码子39由GAC>TAC,导致编码的氨基酸由天门冬氨酸(Asp)>酪氨酸(Tyr);此位点在此之前尚未发现过碱基突变。结论建立了针对HLA-C基因第2—4外显子的通用引物直接测序法,并提出了模棱两可结果的解决策略,所测标本均获得确切高分结果;四川汉族人群中HLA-C等位基因呈现多样性并存在自身特点。

血小板输注效果和HLA-C基因关联性研究

目的 研究血小板输注效果与HLA-C基因的关联性。方法 选取HLA抗体检测阳性患者72名进行血小板交叉配型实验,从中筛选出合适供者的血小板给患者输注,采用PCR-SSP方法分别对患者和供者进行HLA-C位点基因分型;分析HLA-C1和C2两组基因型在血小板输注中的作用。结果 在再生障碍性贫血(AA)患者中血小板输注有效率显著高于急性髓细胞白血病(AML)患者,分别是60.71%(17/28)和39.29%(11/28)。HLA-C1C1相合,在AA和AML患者中,血小板输注有效率均高于无效率;当HLA-C不相合,患者C1C1-供者C1C2和C2C2,在AA和AML患者中,血小板输注有效率均低于无效率,患者C1C2-供者C2C2,在AA患者中血小板输注有效3人次,无效0人次,而在AML中血小板输注有效0人次,无效2人次,患者C1C2-供者C1C1,在AA和AML患者中血小板输注的有效率和无效率相当,当患者C1C1和C1C2-供者C2C2时,在AML患者中血小板输注无效。结论 HLA-C基因型与血小板输注效果有关。

绒毛滋养细胞HLA-C基因多态性与不明原因早期复发性流产的关系

目的:探讨绒毛滋养细胞HLA-C基因与不明原因早期复发性流产(URSA)的关系。方法:留取早期URSA患者33例(早期URSA组)及正常早孕妇女29例(对照组)的绒毛组织,提取基因组DNA,DNA测序法分析绒毛滋养细胞HLA-C1、HLA-C2基因,Fisher精确概率法计算两组间差异。结果:①两组的HLA-C1、HLA-C2基因在绒毛组织中呈不平衡表达,均以HLA-C1基因占明显优势。早期URSA组HLA-C1基因频率(66.67%)与对照组(81.03%)比较,差异无统计学意义(P=0.657);早期URSA组HLA-C2基因频率(33.33%)高于对照组(19.07%)(P=0.007)。②在早期URSA组中HLA-C1/C2基因型(66.67%)占明显优势;对照组中HLA-C1/C1基因型占明显优势(65.52%);早期URSA组的HLA-C1/C1和HLA-C1/C2基因型频率与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.039;P=0.001)。结论:早期URSA患者HLA-C1/C1基因型频率降低、HLA-C1/C2基因型增加,导致单倍型HLA-C1频率降低,HLA-C2基因频率升高,HLA-C1、HLA-C2失衡可能与早期URSA的发病相关。

造血干细胞移植供受者HLA-C分子结构分析

目的 观察造血干细胞移植 (HSCT)供受者HLA C分子结构差异 ,探讨免疫抑制信号系统在HSCT后GVHD中的作用。方法 利用DNA测序和蛋白质三维空间结构模拟分析方法回顾性观察HSCT后发生GVHD的供受者的HLA C分子结构差异。结果 HLA C分子在氨基酸序列、三维空间结构、电性分布和分子表面结构上有明显差异。结论 HSCT供受者间HLA C分子结构差异导致HLA C分子不能被供者免疫细胞的杀伤细胞抑制性受体识别 。

HLA-C和HLA-G基因真核细胞双表达载体的克隆及鉴定分析

目的 构建人HLA C和HLA G基因真核细胞双表达载体。方法 用RT PCR从孕妇蜕膜组织有核细胞总mRNA中逆转录扩增全长HLA C和HLA GcDNA ,首先将HLA G经BamHⅠ和ClaⅠ双酶切 ,HLA C经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后 ,分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点 1(mcs1)和 2 (mcs2 )中 ,然后经酶切和测序鉴定 ,确定已建立pVITRO2的单表达质粒pVITRO2 HLA G和pVITRO2 HLA C ,再将HLA CcDNA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 ,定向插入单表达质粒pVITRO2 HLA G的多克隆位点 2 (mcs2 )中 ,经PCR反应初筛 ,再经双酶切鉴定。结果 限制性内切酶和测序分析表明已成功构建了HLA Cw 0 10 3和HLA G 0 10 1的单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G以及双表达质粒pVITRO2 HLA CG。结论 本研究成功构建了真核细胞双顺反子载体pVITRO2的双表达质粒pVITRO2 HLA CG ,以及单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G。

HLA-C基因5'端-35kb T/C多态性对HIV感染进展影响的研究

目的探讨HLA-C基因5'端-35kb C/T多态性(Rs9264942)在四川汉族HIV感染中的影响。方法采用序列特异性引物扩增(PCR-SSP)方法对四川汉族259例HIV感染进展组,46例HIV感染长期不进展组,和270例四川汉族对照组人群HLA-C基因5'UTR区域-35kb C/T的多态性进行分型。结果 -35kb C/T多态性在HIV感染进展组,HIV感染不进展组及正常对照组人群中各等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡,在HIV感染进展组中:CC频率为15.1%、CT频率41.3%、TT频率43.6%;HIV感染不进展组中:CC频率为21.7%、CT频率39.1%、TT频率39.1%;在正常对照组中:CC频率为18.9%、CT频率43.0%、TT频率38.1%。经统计学检验,-35kb C/T多态性中各等位基因频率在3组人群中没有统计学差异。结论 HLA-C基因-35kb C/T多态性与四川汉族HIV感染者的感染进程没有相关性。

山东地区汉族人群HLA-C基因分组与梅毒的相关性研究

目的探讨HLA-C基因分组与梅毒的相关性,以期发现梅毒的抗性基因型。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法,对山东汉族231例梅毒患者和247例健康个体的HLA-C基因分组进行检测和分析。结果梅毒患者组HLA-C1C1基因型频率显著低于对照组(P<0.05),HLA-C1C2和HLA-C2C2以及HLA-C1组和HLA-C2组的基因型频率在2人群中相比差异无统计学意义。结论在山东汉族人群中HLA-C1C1可能是梅毒的抗性基因型。

HLA-C基因真核细胞表达载体的构建、鉴定及表达

目的 :构建人白细胞抗原 (HLA C)基因真核细胞表达载体 ,在JAR细胞表面表达 ,并对其功能进行探讨。方法 :用RT PCR从人外周血淋巴细胞的总mRNA中逆转录扩增HLA C的cDNA ,克隆到PBluescriptSK + -噬菌粒中 ;测序鉴定后 ,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中。经脂质体转染JAR细胞 ,G4 18筛选阳性克隆 ,FACS检测HLA C分子的表达。转染HLA C分子的JAR细胞再与分离的NK细胞进行细胞毒试验。结果 :限制性内切酶酶切和序列分析表明 ,克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中的HLA C等位基因是HLA Cw 0 6 0 2 ,该分子在JAR细胞株获得高效表达。直接分离的PBL细胞对JAR细胞以及表达HLA C分子的JAR细胞无细胞毒作用 ;而IL 2活化的NK细胞对这些细胞都有细胞毒作用。结论 :HLA C基因的成功表达为研究HLA C分子与NK细胞受体 (KIR)之间的关系奠定了基础 ,NK细胞对JAR细胞的杀伤可能存在不依赖HLA C分子的机制。

造血干细胞移植aGVHD中HLA-Cw错配的意义

目的:回顾性研究HLA-A、B、DR相合时,BMT/PBSCT术后aGVHD的发生与HLA-Cw配合程度的相关性。方法:采用半量扩增体积RSSOP技术对2000年1月-2001年6月进行BMT/PBSCT的白血病患者及其供者20对(同胞BMT/PBSCT 16对和无关供者BMT/PBSCT 4对)进行HLA-Cw基因分型,对其中5例HLA-Cw错配供受者与临床移植过程中aGVHD的发生情况进行关联分析。结果:16对HLA-A、B、DR相合的同胞BMT/PBSCT供受者中4对HLA-Cw等位基因错配(半相合和不相合者各2例)发生严重aGVHD(≥Ⅲ°)1例,4例无关BMT/PBSCT供受者中2例发生严重aGVHD(DRB1和Cw错配各1例),统计学显示Cw配合对降低aGVHD未见显著意义。结论:研究提示,同胞或亲缘遗传背景下HLA-A、B、DR全相合时Cw错配与aGVHD无相关性,但无关供受者HLA-Cw错配可能对严重aGVHD的发生具有影响。

银屑病患者骨髓CD34^+细胞HLA-C和PDCD1表达的研究

目的:研究HLA-C(histocompatibility complex class C)和PDCD1(programmed cell death 1)在银屑病患者骨髓CD34^+细胞中的表达,以揭示银屑病患者造血干细胞的活性。方法:采用免疫磁珠法分离CD34^+细胞,RT-PCR法分别检测HLA-C、PDCD1的mRNA表达。结果:银屑病患者骨髓CD34^+细胞HLA-CmRNA表达水平高于正常对照组(P<0.05),PDCD1 mRNA表达在银屑病组与正常对照组间比较无统计学意义(P>0.05),未发现HLA-C mRNA表达水平与银屑病皮损面积和疾病活动性指数(PASI)评分有直线相关性。结论:影响CD34^+细胞发育分化的某些基因在银屑病患者骨髓CD34^+细胞中表达异常,这些基因表达水平的异常可能引起骨髓造血干细胞活性异常,并参与银屑病的发病。

绒毛滋养细胞HLA-C基因多态性与早期复发性流产关系研究

目的探讨绒毛滋养细胞HLA-C基因的多态性与早期复发性流产(ERSA)之间的关系。方法留取53例ERSA患者(观察组)及63例非ERSA者(对照组)的绒毛组织基因组DNA,运用DNA测序法分析绒毛滋养细胞HLA-C1、HLA-C2基因序列,并加以对照分析。结果两组间的HLA-C1、HLA-C2基因组在绒毛组织中呈现不平衡性表达。观察组HLA-C1和HLA-C2基因频率分别为66.04%、33.96%,对照组分别为85.71%、14.29%;两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HLA-C1、HLA-C2基因失衡是ERSA发病的重要遗传因素,为探讨ERSA发病机制提供了新的依据。

运用全长序列鉴定HLA-C罕见基因的实验研究

目的检测与分析2例骨髓志愿捐献者携带的罕见等位基因。方法用快速DNA提取试剂盒从全血样本中提取基因组DNA,经HLA-C基因商品化测序分型试剂盒扩增,纯化后的扩增产物作为模板用试剂盒配套的第2、3、4外显子正反向测序引物及自行研制的第5外显子正反向、第6外显子正向和第7外显子反向测序引物进行测序,结果导入Assign-SBT3.5.1.45软件分析,并用PCR序列特异性引物技术(SSP)对标本进行确认。结果分型结果显示其中一例为HLA-C*07:63,另一例为HLA-C*01:24。结论临床移植配型遇罕见基因时应测定全长序列以提高分型结果的准确性,此两例罕见等位基因为中华骨髓库建立HLA高分辨数据库提供了有效依据。

贵州省布依族和苗族HLA-C基因rs3130542位点多态性研究

目的:研究HLA-C基因rs3130542位点在贵州省布依族和苗族人群中的分布特征,探讨该位点在不同群体间的分布差异。方法:应用Taq Man-MGB探针基因分型方法,检测贵州布依族(289例)和苗族(174例)群体HLA-C基因rs3130542 SNP多态位点的基因频率及基因型频率,比较同一性别不同民族及同一民族不同性别人群间HLA-C基因rs3130542 SNP多态位点的基因频率及基因型频率,并与人类基因组计划网站公布的中国北京人群、日本人群、欧洲人群及非洲人群的分布特点进行比对。结果:布依族和苗族群体比较HLA-C基因rs3130542位点等位基因频率和基因型频率差异有统计学意义(P<0.05),同一民族群体不同性别之间比较HLA-C基因rs3130542位点多态性分布差异均无统计学意义(P>0.05);与人类基因组计划网站公布的其他人群相比,贵州苗族布依族人群HLA-C基因rs3130542位点的基因型频率与中国北京人群间差异有统计学意义(P<0.05),等位基因和基因型频率与日本人群间差异均有统计学意义(P<0.05),但与欧洲人群间差异无统计学意义(P>0.05),等位基因频率与非洲人群间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:HLA-C基因rs3130542位点在不同地域、不同民族或种族之间分布存在一定的差异;但在贵州省苗族和布依族同一民族男女性别中的分布差异无统计学意义。

定量PCR检测HLA-C等位基因表达方法的建立和初步应用

目的:建立实时定量PCR方法检测同一个体两条不同的HLA-C等位基因的表达水平。方法:构建HLAⅠ类等位基因外显子2和3数据库,设计等位基因特异性系列引物,建立等位基因定量PCR方法;在数据库和835例汉族人外周血标本中对方法进行理论和实验验证;检测并比较20对肝癌和癌旁组织标本中HLA-C等位基因的表达水平。结果:本实验设计的20对引物能检测23种杂合基因型中不同的HLA-C等位基因,覆盖汉族人群中出现频率大于0.96%的个体;55%(11/20)的肝癌组织中HLA-C位点两条等位基因表达水平变化不一致。结论:成功建立了针对汉族人群的HLA-C等位基因表达水平的检测方法;肝癌组织中普遍存在着两条HLA-C等位基因表达水平变化不一致的现象。