HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化

目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoRⅠ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体。分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc]。对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Westernblot检测HLA-DR1的表达。结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。ELISA和Westernblot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象。结论成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础。

HLA-DRB1结合性变构肽对T细胞活化的竞争性抑制作用

目的:研究去除T细胞受体(TCR)识别表位的HLA-DRB1结合性Ⅱ型胶原(CⅡ)变构肽对T细胞活化的抑制作用.方法:将人CⅡ的抗原性片段(CⅡ263-272)中与T细胞识别有关的268～270位氨基酸分别用丙氨酸和甘氨酸替换,形成CⅡ变构肽S268-270,并将该多肽与表达HLA-DR1的抗原呈递细胞(APC)及抗原性原型CⅡ263-272多肽共同孵育,研究变构肽S268-270在竞争性抑制CⅡ263-272与HLA-DR1分子结合中的作用;利用HLA-DR1转基因APC及其特异性T细胞,研究S268-270对抗原性CⅡ263-272及流感病毒血凝素(HA)306-318诱导的T细胞活化的抑制作用.结果:CⅡ变构肽S268-270可结合APC表面的HLA-DR1分子,并可抑制CⅡ263-272及HA306-318两种不同抗原诱导的HLA-DR1限制性T细胞活化.结论:替换CⅡ263-272中与TCR识别有关的氨基酸所形成的CⅡ变构肽S268-270可与APC表面的HLA-DR1分子结合,并可抑制HLA-DR1结合性抗原肽CⅡ263-272及HA306-318诱导的T细胞活化.CⅡ变构肽S268-270可能对类风湿关节炎患者的HLA-DR1限制性T细胞异常活化具有抑制作用.

昆明白族儿童幽门螺杆菌感染与HLA-DR/DQB1的免疫遗传学分析

目的了解昆明白族儿童幽门螺杆菌感染与HLA-DR/DQB1等位基因的相关性。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物技术对符合流行病学诊断标准的36例H.pylori感染患儿及34例非感染儿童进行HLA-DR/DQB1基因分型。结果感染组检出15种DRB1等位基因,非感染组检出11种DRB1等位基因,两组均检出7种DQB1等位基因;组间各等位基因频率经检验,差异无统计学意义。结论白族儿童中H.pylori感染和非感染组的HLA-DR/DQB1等位基因频率无免疫遗传学差异;白族儿童H.pylori感染与HLA-DR/DQB1可能无关。

电针治疗转基因鼠类风湿性关节炎的HLA-DR_4β_1基因调控机制

目的以转基因鼠为研究对象,运用现代生物技术,从免疫学,遗传学等角度深入系统地探讨电针对类风湿性关节炎易感基因调控机制。方法采用人类HLA-DR4β1基因转基因小鼠,转基因阴性小鼠和非转基因小鼠胶原性关节炎为疾病模型,以电针为主要治疗方法,将大于5周龄的小鼠随机分成电针治疗组、甲氨喋呤对照组和模型对照组,运用分子生物学、遗传学、免疫学等多种手段和技术,从动物细胞、分子水平,研究电针治疗RA的特点和环节,并阐明其作用机理。结果①电针可以抑制T淋巴细胞的活化;②电针在调控类风湿性关节炎易感基因的表达中有一定的作用。结论电针通过调控类风湿性关节炎易感基因的表达,影响MHCⅡ类分子的抗原递呈功能达到对CIA小鼠的治疗目的。

利用HLA-DRβ1亚型同源多肽筛选类风湿关节炎相关抗原的研究

目的 :筛选与类风湿关节炎易感基因HLA DRβ1亚型同源多肽结合的抗原性蛋白。方法 :利用HLA DRβ1亚型同源多肽亲和层析柱结合类风湿关节炎患者B细胞可溶性蛋白 ,并以pH梯度洗脱获取HLA DRβ1同源多肽结合蛋白。 结果 :类风湿关节炎易感基因HLA DRβ1亚型同源多肽可高亲和力结合II型胶原、热休克蛋白 90和组蛋白等 5种抗原蛋白。 结论 :II型胶原及热休克蛋白 90可能通过与HLA DRβ1分子形成二聚体复合物参与类风湿关节炎的发病。

冠心病合并2型糖尿病患者冠状动脉周围脂肪组织关键差异表达基因筛选及分析

目的分析冠心病(CAD)合并2型糖尿病(T2DM)患者冠状动脉周围脂肪组织(PCAT)中的差异表达基因,筛选CAD合并T2DM的关键差异表达基因,并进行验证。方法在GEO数据库官网选取芯片GSE64554、GSE120774、GSE16415、GSE71416信息,筛选在CAD、T2DM均呈差异表达的基因,进行功能注释和通路分析,获得CAD合并T2DM的关键差异表达基因。选择行心脏瓣膜置换术的患者、CAD患者和CAD合并T2DM患者各20例分别纳入对照组、CAD组和CAD+T2DM组,选择术中留取的PCAT,采用RT-qPCR法检测三组PCAT中的关键差异表达基因。结果共得到CAD、T2DM患者PCAT中均呈差异表达基因54个,根据功能注释得到3个关键基因即人Ⅱ类主要组织相容性复合体DRβ1(HLA-DRβ1)、肿瘤蛋白53(TP53)、CC趋化因子受体9(CCR9)。对照组、CAD组、CAD+T2DM组TP53基因相对表达量依次增高(P均<0.05)。CAD组和CAD+T2DM组CCR9表达高于对照组(P均<0.05)。CAD+T2DM组HLA-DRβ1表达高于对照组(P<0.05)。结论CAD合并T2DM患者PCAT中关键差异表达基因为HLA-DRβ1、TP53和CCR9,其中TP53基因在CAD合并T2DM患者PCAT中表达变化显著,可能有助于CAD合并T2DM的诊断。

HLA-DRβ1*04亚型的氨基酸序列与类风湿关节炎易感相关性分析

目的研究HLA-DRβ1*01亚型的氨基酸序列与类风湿关节炎易感性的关系.方法选取类风湿关节炎患者136例,其他疾病对照组79例,以序列特异性引物PCR(PCR-SSP)技术对HLADRβ1 *04的36种基因亚型进行检测,并分析患者临床表现及血清学指标与各亚型氨基酸序列之间的关系.结果136例类风湿关节炎患者中46例出现HLA-DRβ1*04亚型阳性(33.8%),明显高于疾病对照组(12.7%)(OR=3.52,95%CI=1.43～5.43,P=0.001);RA患者的HLA-DRβ1*04亚型中的谷氨酰胺-赖氨酸或精氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸(QK/RRAA)序列(22.1%)和谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-谷氨酸(QRRAE)序列(9.6%)均分别高于疾病对照组(10.1%和1.3%)(OR=2.51、8.24,95%CI=1.05～4.52和1.01～56.64,P＜0.05);HLA-DRβ1*04亚型阳性组、QK/RRAA序列组及QRRAE序列组的关节畸形发生率、血清CRP和RF的阳性率均明显增高(P＜0.05);而含有QK/RRAA序列组与含有QRRAE序列组比较各项指标差异均无显著性(P＜0.05).结论HLA-DRβ1*04亚型是RA易感基因;携带QRRAE与QK/RRAA序列的RA患者关节受累明显,易发生关节畸形;HLA-DRβ1*04亚型中QRRAE序列与QK/RRAA序列均与RA的易感性有关.

HLA-DRβ1特异性非T细胞结合肽对胶原性关节炎的抑制作用

目的 研究HLA DRβ1特异性非T细胞结合肽对胶原性关节炎的抑制作用 ,探索类风湿关节炎新的免疫治疗方法。方法 以丙氨酸及甘氨酸替换Ⅱ型胶原 (CⅡ ) 2 6 3 2 72多肽中与T细胞受体结合的氨基酸 ,利用HLA DR1转基因抗原呈递细胞及CⅡ特异性T细胞组成的激活体系 ,从这些CⅡ 2 6 3 2 72修饰肽中筛选非T细胞结合肽。牛CⅡ +完全福氏佐剂诱导大鼠胶原性关节炎 (CIA)动物模型 ,应用不同剂量 (10、5 0、10 0 μg)的非T细胞结合肽 2 6 8A皮下注射进行为期 16d的治疗 ,观察大鼠关节肿胀的变化情况。酶联免疫吸附法 (ELISA)检测外周血CⅡ抗体和肿瘤坏死因了 (TNF) α浓度 ,HE染色检测CIA病理变化。结果 7条CⅡ 2 6 3 2 72修饰肽中以丙氨酸替换第 2 6 7、2 6 8、2 6 9、2 70位残基的 4条肽 (2 6 7A、2 6 8A、2 6 9A及 2 70A)和用丙氨酸和甘氨酸连续替换 2 6 8、2 6 9、2 70位残基的 1条肽 (Sub2 6 8 2 70 )对T细胞激活能力显著低于原型肽 (P <0 0 1)。利用 2 6 8A多肽对CIA进行治疗的结果发现 ,3个治疗组CIA缓解率显著高于对照组 (P <0 0 5或P <0 0 1) ;3个治疗组的关节炎评分显著低于对照组 (P <0 0 5或P <0 0 1)。 3个治疗组TNF α浓度及CⅡ抗体浓度均显著低于对照组 (P <0 0 5或P <0 0 1)。

类风湿关节炎相关的HLA-DRβ_1亚型对蛋白激酶A信号的影响

目的 研究类风湿关节炎 (RA)相关的HLA DRβ1基因亚型对细胞内蛋白激酶A(PKA)信号通路的影响。方法 测定HLA DRβ1 0 40 1、 0 40 2、 0 40 3、 0 40 4亚型转基因细胞内PKA、cAMP及腺苷环化酶 (AC)的浓度及活性。结果 RA相关的HLA DRβ1 0 40 1和 0 40 4转基因细胞的PKA活力、cAMP水平及AC活力明显低于HLA DRβ1 0 40 2和 0 40 3转基因细胞 (P值均 <0 .0 1)。结论 RA共同表位QK/RRAA的表达可抑制PKA、cAMP和AC的活性 。

Impact of rheumatoid arthritis-associated HLA-DRβ1 subtypes on protein kinase A signaling

Objective To investigate the impact of rheumatoid arthritis (RA)-associated HLA-DRβ1*0401, *0402, *0403, *0404 and *0101 subtypes on the protein kinase A (PKA) signaling pathway. Methods Adenylate cyclase (AC), cAMP and PKA activity in transfectants expressing RA-associated HLA-DRβ1 subtypes and their mutants were detected. Results Compared to HLA-DRβ1*0402 transfectants, the RA-associated HLA-DRβ1*0401, *0404 and *0101 transfectants produced significantly lower levels of AC, cAMP and PKA. Conclusion RA-associated HLA-DRβ1 molecules are involved in the pathogenesis of RA through down-regulation of the PKA signaling pathway.

人类白细胞抗原DRB1和DQB1基因与自身免疫性甲状腺疾病易感性的关系

目的 探讨自身免疫性甲状腺疾病的遗传易感性与人类白细胞抗原 (HLA) DRB1、HLA DQB1基因之间的相关性。方法 应用聚合酶链反应 序列特异性引物 (PCR SSP)技术对已经确诊的湖北汉族儿童桥本甲状腺炎 46例、Graves病 2 0例、单纯性甲状腺肿 2 7例和正常对照组 193名进行HLA DRB1、HLA DQB1基因多态性分析。结果 桥本甲状腺炎患儿组HLA DRB1 0 90 1、HLA DQB1 0 80X和HLA DQB1 0 30 3等位基因频率较正常对照组显著增高 (统计学分析分别为 6 7%、2 8.5 % ,RR =5 .2 ,P =1.9× 10 -6;39%、16 .1% ,RR =3.4,P =1.0× 10 -3 和 5 6 %、35 .0 % ,RR =2 .4,P =1.1×10 -3 )。Graves病患儿组则仅见HLA DRB1 0 90 1基因频率较正常对照组显著增高 (6 5 %、2 8.5 % ,RR =4.7,P =1.8× 10 -3 )。结论 桥本甲状腺炎和Graves病的发病与HLA DRB1 0 90 1密切关联 ,且桥本甲状腺炎的发病还与HLA DRB1 0 80X和HLA DQB1 0 30 3关联。提示它们是中国湖北汉族人自身免疫性甲状腺疾病的易感基因。

类风湿关节炎共同表位QK/RRAA对蛋白激酶A通路的抑制作用

目的 研究类风湿关节炎 (RA)共同表位QK/RRAA及其变异对细胞内蛋白激酶A(PKA)信号通路的影响。方法 测定HLA DRβ1 0 40 4及其变异体转基因细胞内PKA、cAMP及腺苷环化酶 (AC)的浓度及活性。结果 HLA DRβ1 0 40 4转基因细胞的PKA活力、cAMP水平及AC活力明显低于HLA DRβ1 0 40 3转基因细胞株 (P <0 0 1)。HLA DRβ1 0 40 4序列第 70～ 74位氨基酸QRRAA中的Q70 及A74 是抑制PKA信号通路的关键氨基酸。结论 类风湿关节炎共同表位QK/RRAA的表达可抑制PKA、cAMP和AC的活性 。

原发性胆汁性肝硬化患者人类白细胞抗原等位基因多态性分析

目的探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者人群与人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类(A、B)、Ⅱ类(DRB1)等位基因的相关性,同时评估易感基因是否与一些临床及实验室特征存在联系。方法利用序列特异性聚合酶链反应(SSP-PCR)对65例确诊的PBC患者和431名健康人进行HLA—A、B和DRB1 等位基因以及有关基因亚型分析。结果PBC患者DRB1*07的频率增高到29.2%,与正常人13.9%的频率相比,差异具有统计学意义(Pc<0.05,OR=2.55,95%CI:1.4～4.6);所有DRB1*07阳性患者经亚型分析均为DRB1*0701。未发现DRB1*08与PBC有关联性。Ⅰ类抗原中以A*2在PBC患者组的频率最高(53.8%),稍高于对照组,但无统计学意义。其余HLA-A、B和DRB1的等位基因频率与正常人相比较,差异无统计学意义。DRB1*0701阳性患者与阴性患者在一些临床、实验室指标上差异并不明显。结论PBC与HLA-DRB1*0701基因相关,与南美、北美、北欧、日本等其他国家PBC患者的易感基因明显不同;HLA-DRβ1第78位上的缬氨酸残基可能与PBC发病相关。