NKG2A-HLA-E轴介导NK细胞应答在病毒感染性疾病中的作用及机制研究进展

自然杀伤(NK)细胞主要通过迅速释放细胞毒性介质以及细胞因子直接杀伤病毒感染的靶细胞。NK细胞表面抑制性和活化性受体的平衡以及靶细胞上相应配体的表达均参与调控NK细胞的杀伤功能。其中NK细胞2组成员A(NKG2A)是NK细胞上备受关注的抑制性受体之一,通过与其配体人类白细胞抗原E(HLA-E)的相互作用,可抑制NK细胞对自身正常组织细胞的杀伤活性。研究发现病毒感染细胞表面HLA-E表达上调,并且可与病毒蛋白来源的多肽结合形成复合物,通过与NKG2A的相互作用调控NK细胞功能,从而参与病毒感染性疾病发病过程。本文总结了NKG2A与HLA-E分子互作特点,以及NKG2A-HLA-E轴参与调控NK细胞的功能机制,有助于了解NK细胞在病毒感染性疾病中的重要作用。

HLA-E、HLA-G及P16蛋白与宫颈癌患者高危型HPV感染的相关性

目的研究人类白细胞抗原(HLA)-E、HLA-G及P16蛋白与宫颈癌患者高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染的相关性。方法前瞻性选择2019年1月至2022年11月于湖北民族大学附属民大医院接受治疗的宫颈癌患者82例纳入宫颈癌组,选择同期于本院接受治疗的宫颈上皮内瘤变(CIN)患者64例为CIN组,选择同期于本院健康体检的正常女性60名纳入对照组。3组均行血清HLA-E、HLA-G水平、P16蛋白及HPV分型检测。观察3组HR-HPV分布、血清HLA-E、HLA-G水平及P16蛋白表达情况;观察不同CIN分级患者血清HLA-E、HLA-G水平及P16蛋白表达情况;观察HR-HPV感染宫颈癌不同病理特征患者血清HLA-G、HLA-E及P16蛋白表达情况;分析HLA-E、HLA-G及P16蛋白与HR-HPV感染宫颈癌患者HPV的相关性。结果宫颈癌组HR-HPV检出率大于CIN组、对照组,CIN组HR-HPV检出率大于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组ⅡA期患者HR-HPV感染率高于CIN组Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级及对照组患者,宫颈癌组IB期患者HR-HPV感染率高于CIN组Ⅰ级、Ⅱ级及对照组患者,CIN组Ⅲ级、Ⅱ级患者HR-HPV感染率高于CIN组Ⅰ级及对照组患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组血清HLA-E、HLA-G水平及P16蛋白阳性表达率均高于CIN组、对照组,CIN组血清HLA-E、HLA-G水平及P16蛋白阳性表达率均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。CINⅡ级、CINⅢ级患者血清HLA-E、HLA-G水平及P16蛋白阳性表达率均高于CINⅠ级患者,CINⅢ级患者血清HLA-E、HLA-G水平及P16蛋白阳性表达率均高于CINⅡ级患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。HR-HPV感染宫颈癌不同年龄、病理类型及是否绝经患者血清HLA-G、HLA-E水平及P16蛋白阳性率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);不同FIGO分期、分化程度、HPV阳性分级患者血清HLA-G、HLA-E水平及P16蛋白阳性率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。经Pearson相关分析,血清HLA-G、HLA-E水平及P16蛋白与宫颈癌患者HR-HPV感染呈正相关(P<0.05)。结论高危型HPV持续感染是导致宫颈良性病变并进展为宫颈癌的重要因素。血清HLA-E、HLA-G水平升高及P16蛋白高表达是宫颈癌患者的重要特征。血清HLA-G、HLA-E水平及P16蛋白与宫颈癌患者HR-HPV感染正相关。

HLA-E基因表达沉默对人乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨HLA-E基因表达对人乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为的影响,分析靶向HLA-E基因的小分子RNA干扰(siRNA)技术应用于乳腺癌治疗的可行性。方法:设计并合成靶向HLA-E基因的特异性siRNA序列,转染至人乳腺癌细胞MDA-MB-231,同时设立空白对照组、阴性对照组及脂质体组。实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot法分别检测各组乳腺癌细胞HLA-E mRNA及蛋白的表达;CCK-8法和流式细胞术检测各组乳腺癌细胞增殖率和凋亡率;Transwell实验检测各组乳腺癌细胞侵袭和迁移能力。结果:乳腺癌细胞转染HLA-E siRNA后,HLA-E mRNA及蛋白表达水平明显降低。与阴性对照组相比,HLA-E siRNA转染组乳腺癌细胞增殖率降低(P<0.01);凋亡率增加(P<0.01);侵袭迁移能力降低(P<0.01)。结论:靶向人乳腺癌细胞HLA-E基因的siRNA能有效抑制其基因表达,进而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低乳腺癌细胞侵袭和迁移能力。

非经典HLA Ⅰ类分子(HLA-G和HLA-E)在人肿瘤细胞系的表达及IFN-γ的调节作用

目的：探讨非经典HLA Ⅰ类分子在人肿瘤细胞系的表达及IFN－γ的调节作用。方法：用RT－PCR法检测12种肿瘤细胞系和人脑胶质瘤组织及妊娠妇女滋养层组织标本HLA－G和HLA－E mRNA的表达。结果：人脑胶质瘤组织及妊娠妇女滋养层组织均有HLA－G和HLA－E mRNA的表达；12株肿瘤细胞中仅人T细胞淋巴瘤Karpas存在HLA－G3的mRNA表达，经IFN－γ处理后，Karpas出现HLA－G1／G5和HLA－G2／G4的表达，宫颈癌Hela细胞、黑色素瘤M21细胞和膀胱癌T24细胞出现HLA－G3 mRNA的表达；12株肿瘤细胞中有9株表达HLA－E mRNA。结论：肿瘤存在HLA－G和HLA－E mRNA的表达，IFN－γ可促进HLA－G mRNA的表达。肿瘤细胞HLA－G和HLA－E的表达可能是肿瘤逃避免疫系统监视的机制之一。

HLA-E基因的多态性对同胞全相合造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的影响

本研究旨在探讨人类非典型HLA抗原E(HLA-E)对同胞全相合造血干细胞移植(HSCT)后巨细胞病毒(CMV)感染的影响。以2005年1月至2011年1月在我院行HLA同胞全相合HSCT患者119例为研究对象,采用PCR和测序方法检测供、受体HLA-E基因多态性。结果表明,HLA-E*0101/0101纯合型占20.17%,HLA-E*0103/0103纯合型占27.73%,HLA-E*0101/0103杂合型占52.10%;HLA-E*0101/0101纯合子组CMV感染15例,CMV感染率为62.50%;HLA-E*0103/0103纯合子组CMV感染16例,CMV感染率为48.48%;HLA-E*0101/0103杂合子组CMV感染20例,CMV感染率为32.25%。含HLA-E*0103基因组与HLA-E*0101/0101纯合子组患者CMV感染率比较,差异有统计学意义(P=0.0295),与CMV疾病的发生率比较,差异仍有统计学意义(P=0.0074)。结论:HLA-E基因多态性对同胞全相合移植后CMV感染和疾病的发生存在影响。

HLA-E siRNA沉默肝癌细胞HLA-E基因的表达

目的针对HLA-EmRNA靶序列不同位点,设计合成多个siRNA链,定量分析其对HLA-E(+)肝癌BEL-7402细胞的基因沉默效率,筛选最佳抑制效果的siRNA。方法用IFN-γ(5×105IU·L-1)诱导BEL-7402细胞表达HLA-E基因,经流式细胞技术纯化后作为靶细胞。设计并合成3条HLA-E siRNA链(A、B、C),将各siRNA(0.1mmol·L-1)经脂质体Lipofectamin 2000转染至靶细胞。采用细胞免疫荧光、流式细胞技术、Western杂交、实时PCR等定量方法,比较48h后各siRNA的基因沉默效果,并观察HLA-E基因沉默对NK肿瘤细胞杀伤的影响。结果与空白对照、非特异组相比,3组(A、B、C组)HLA-E siRNA均明显抑制细胞HLA-E抗原、蛋白产物、mRNA、细胞表面HLA-E分子的表达(P<0.01),B、C组抑制效果接近90%,高于A组(P<0.01)。A、B、C组NK肿瘤杀伤率升高(P<0.01),而B、C组肿瘤杀伤效果高于A组(P<0.01)。结论经筛选的HLA-EsiRNA能特异、高效沉默肝癌细胞HLA-E基因表达,可能抑制其非经典HLA-Ⅰ途径免疫逃避,为肝癌"基因-免疫"治疗提供新的治疗策略。

NKG2D和NKG2A及相应配体MHC-IA/B和HLA-E在急性白血病的表达及意义

本研究旨在初步探讨NK细胞受体NKG2D和NKG2A在初发ALL和AML患者NK细胞、CD3+T细胞的表达其及相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞表达差异性和免疫学意义。用流式细胞术检测NK92细胞对8种白血病细胞系的杀伤效率,并检测60例初发急性白血病患者(ALL和AML各30例)骨髓中NKG2D和NKG2A在NK和CD3+T细胞的表达及其相应配体MHC-I A/B和HLA-E在白血病细胞的表达。结果表明,NK92对不同白血病细胞系的杀伤效率存在差异。ALL患者NK细胞和CD3+T细胞的NKG2D及NKG2A阳性表达率与AML患者相比均无显著差异(p>0.05),但是ALL患者白血病细胞MHC-I A/B和HLA-E阳性表达率均明显高于AML患者(p<0.05)。结论:ALL与AML患者免疫细胞功能的差异性可能与白血病细胞配体表达的不同有关,而与本身NK及T细胞表达的杀伤和抑制性受体无关。

药物对卵巢癌裸鼠移植瘤组织中HLA-G和HLA-E表达的影响

目的探讨天花粉蛋白、米非司酮、顺铂在卵巢恶性肿瘤治疗中的作用机制。方法培养卵巢癌OVCAR3细胞株。制备人卵巢癌裸鼠移植瘤模型。将裸鼠随机分为5组:对照组、天花粉蛋白组、米非司酮组、顺铂组、顺铂和米非司酮联合用药组。观察各组裸鼠皮下移植瘤体积,采用RT-PCR方法和流式细胞技术检测其中人类白细胞抗原G(HLA-G)、人类白细胞抗原E(HLA-E)mRNA和蛋白表达情况。结果(1)各用药组移植瘤体积均明显小于对照组(P<0.01),米非司酮组和顺铂组对肿瘤的抑制率明显低于联合组(P<0.01)。(2)和对照组比较,HLA-G、HLA-E、mRNA和蛋白表达在顺铂组无明显改变(P>0.05),在其余各组都显著降低(P<0.01)。HLA-GmRNA和蛋白表达之间呈正相关(r=0.692,P<0.01)。HLA-EmRNA和蛋白表达之间呈正相关(r=0.472,P<0.01)。HLA-GmRNA和蛋白表达与HLA-E呈正相关(r分别为0.388和0.668,P<0.05)。结论与顺铂不同,天花粉蛋白和米非司酮的抗肿瘤作用机制之一是能够明显下调肿瘤组织中HLA-G和HLA-E的表达水平,同顺铂联合使用,有望取得更好的治疗效果。

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLAE真核表达载体,并使其在HLAI类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PCR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2/EcDNA,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,构建成HLAE真核表达载体pcDNA3.1(+)/A2E,然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞,最后经G418筛选及有限稀释,利用抗HLAE特异的单克隆抗体K01263进行FACS检测,以观察HLAE分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示,HLAE分子在经pcDNA3.1(+)/A2E转染的靶细胞表面获得表达(27.76%),而经空载体pcDNA3.1(+)转染的靶细胞则未获得表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)/A2E真核表达载体,并使HLAE分子在HLAI类阴性的K562细胞表面表达,为进一步研究HLAE作用的分子机制以及探索HLAE与NK受体之间的相互作用和HLAE体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。

肝癌HLA-E基因的表达及对判断肝癌肝移植疗效的意义

目的 观察肝癌患者人类白细胞抗原-E（HLA-E）及相关抗原的表达,以及其对判断肝癌肝移植预后的可行性和价值.方法 回顾性研究40例肝癌肝移植患者,检测HLA-ABC、HLA-E、抗原提呈辅助分子（β2-M、TAP）抗原在其原发灶和癌旁硬化组织中的表达,逆转录PCR法检测石蜡标本中HLA-E mRNA的表达,并将各抗原表达情况与肝移植的预后进行统计学分析.结果 与癌旁组织相比,癌巢HLA-ABC表达增强12例（30%）,一致21例（52.5%）,相对下调7例（17.5%）.HLA-E抗原在癌旁组织中表达不明显,癌巢阳性表达（＋＋/＋）为29例（72.5%）,P＜0.01,肝癌标本可检测出HLA-E mRNA的表达.β2-M和TAP在癌巢和癌旁组织中均有相同程度的表达,无统计学意义.随访期内HLA-E（＋＋/＋）患者移植后无瘤生存期较短（P＜0.05）.结论 肝癌HLA-E异常表达影响肝癌肝移植的疗效,提示其在肝癌免疫逃避中的重要作用.

Tapasin对HLA-E细胞表面表达的影响

目的 :探索伴侣分子Tapasin对HLA E分子细胞表面表达的影响。方法 :体外构建HLA EcDNA的逆转录病毒表达载体 ,并通过感染的方法将其转入Tapasin阴性的T2细胞系 ,利用流式细胞术检测HLA E分子在靶细胞表面的表达情况。结果 :外源HLA E基因在Tapasin阴性的T2细胞表面获得表达 (74 13% ) ,而对照细胞及经空载体转染的T2细胞表面未检测到HLA E分子的表达。结论 :HLA E分子的细胞表面表达也存在TAP非依赖的方式。

HLA-E cDNA克隆及在LcL721.221细胞的表达

目的克隆 HL A- E c DNA,并使其在 HL A 类阴性的靶细胞 L c L72 1.2 2 1细胞上获得稳定表达。方法用 RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞扩增出 HL A - E c DNA ,并通过内核糖体进入位点 (IRES)将目的基因亚克隆于已经载有 HL A-A2的逆转录病毒表达载体 p GCEN上 ,构建成 HL A - A 2 / E多顺反子表达载体 (p G/ A2 E) ,采用感染的方法将重组质粒转入L c L 72 1.2 2 1细胞 ,最后经 G418筛选及有限稀释 ,利用抗 HL A- E特异的单克隆抗体 3D12进行 FACS检测 ,以观察 HL A - E分子在靶细胞表面的表达情况。结果 HL A- E分子在经 p G/ A2 E转染的靶细胞表面获得明显的表达 (88.79% ) ,且显著高于表达 HL A- E的对照细胞株 JAR(2 6 .2 1% ) ,而经 p G/ A2载体转染的靶细胞则未获得表达。结论成功构建了 p G/ A2 E多顺反子表达载体 ,并使 HL A- E分子在 HL A 类阴性的 L c L72 1.2 2

HLA-E基因多态性与白血病的相关研究

目的探讨HLA-E基因多态性与白血病的相关性,为白血病的发生发展机制提供新的分子标记。方法提取白血病患者组(n=59)及正常人群(对照)组(n=132)外周血DNA,利用长片段高保真PCR方法做HLA-E全长序列扩增并对HLA-E的第3外显子测序并分型;分别计算2组中各基因型的频率及各等位基因的频率。结果白血病患者组:共检出35例纯合子,检出率59.3%(35/59),其中29例(49.2%)为HLA-E*01:03纯合子、6例(10.2%)为HLA-E*01∶01纯合子;正常对照组:共检出62例纯合子,检出率47.0%(62/132)其中36例(27.3%)为HLA-E*01:03纯合子、26例(19.7%)为HLA-E*01∶01纯合子;白血病患者组和正常对照组HLA-E*01∶03等位基因频率分别为69.5%vs 53.7%(P<0.01),2组HLA-E*01∶03纯合子比例分别为49.2%vs 27.3%(P<0.01,OR=2.1)。结论 HLA-E*01∶03是白血病的易感基因。

南方汉族人群HLA-E基因测序分型及其分子遗传多态性研究

目的研究南方汉族人群HLA-E基因的分子遗传多态性。方法随机选择150人份南方汉族健康无关个体,采用1对PCR引物特异性扩增HLA-E基因第1-5外显子目的序列,纯化后的PCR扩增产物作为测序模板,对HLA-E基因的第2、3、4外显子进行双向测序,测序反应产物纯化后经ABI3730测序仪电泳,用Assign 3.5 SBT软件分析结果。结果所检测的150例标本均扩增出清晰的目的条带,对HLA-E基因外显子2-4进行双向测序,所获得的序列无背景信号和杂峰。检出了2种HLA-E等位基因,其中HLA-E*01∶01等位基因频率为0.42,HLA-E*01∶03等位基因频率为0.58。3种HLA-E基因型频率的分布符合Hardy-weinberg平衡定律。结论本文所获得了南方汉族人群HLA-E基因分子遗传多态性等基础数据,可为HLA-E的疾病关联研究、临床移植等提供重要参考。

HLA-E基因与allo-HSCT移植效果关系的研究

目的:探讨HLA-E基因与异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)效果的关系。方法:用PCR-SSP方法分别检测22对allo-HSCT供者及受者的HLA-E基因型,并分2组:供受者HLA-E相合组和供受者HLA-E不合组。比较2组在移植后植入率、移植物抗宿主病(GVHD)、免疫重建、自体恢复或恶性病复发等方面的差异。结果:22对移植病例的供受者中,共检出3个HLA-E等位基因,分别为E*0101、E*01031和E*01032,未检出E*0102和*0104。供受者HLA-E相合组9对,供受者HLA-E不合组13对。两组在移植后植入率、GVHD、免疫重建、自体恢复或恶性病复发等无统计学差异。结论:HLA-E基因多态性与allo-HSCT移植效果未见相关性。

HLA-DR_3基因对特应性皮炎患者免疫应答的调节

目的:探讨HLA-DR3基因对特应性皮炎(AD)患者免疫应答的调节机制。方法:采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)检测特应性皮炎患者的HLA-DRB等位基因型,采用放射变应原吸附实验(RAST)检测血清特异性IgE。结果:外源性特应性皮炎(EAD)组HLA-DR3基因频率高于对照组(P<0.05,RR=5.27),而HLA-DR6基因频率低于对照组(P<0.05,RR=0.10)。内源性特应性皮炎(IAD)组各等位基因与对照组比较均无统计学意义。在HLA-DR3阳性的10例EAD患者中,1例抗h1sIgE阳性,1例抗d1sIgE阳性,7例抗d2sIgE阳性,2例抗mx2sIgE阳性,2例抗fx5EsIgE阳性,HLA-DR3与抗d2sIgE有关,列联系数为0.48(P<0.05)。结论:HLA-DR3可能是AD的易感基因,而HLA-DR6可能是AD的抗性基因,同时携带有HLA-DR3的个体对粉尘螨的特异性变态反应可能是引发AD的病理机制之一。

HCMV感染与滋养细胞HLA-E蛋白表达的相关性

目的:研究HCMV感染与滋养细胞HLA-E蛋白表达的相关性。方法:体外分离、培养的滋养细胞系HTP-8,用HCMV AD169标准病毒株感染细胞。免疫荧光法检测HCMV感染后滋养细胞中HLA-E蛋白的表达。结果:病毒感染后10天内,细胞胞浆和胞膜均有HLA-E蛋白表达,感染后1-5天表达水平较低,6-10天表达强度显著增强。结论:滋养细胞HLA-E蛋白的表达与HCMV感染有相关性。

江苏地区汉族人群HLA-E基因多态性分析

目的通过调查江苏地区汉族人群人类白细胞抗原-E(HLA-E)等位基因多态性分布情况,为探讨HLA-E基因多态性与疾病关联奠定基础。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法,调查217例江苏地区汉族献血人群HLA-E的表达。结果检测到HLA-E的2个等位基因,分别是HLA-E*01:01和HLA-E*01:03,分布频率为41.47%和58.53%;基因型HLA-E*01:01/01:01、01:01/01:03和01:03/01:03的频率分别为14.74%、53.46%和31.80%,分布符合Hardy-weinberg平衡定律。结论江苏地区汉族人群HLA-E高度保守,仅有2种基因型。

胎盘绒毛HLA-E mRNA的表达与早期自然流产关系的初步研究

目的研究早期自然流产患者胎盘绒毛HLA-E mRNA表达水平的变化,探讨其与早期自然流产的关系.方法分别收集13例6～12wk自然流产与正常早孕人流刮宫患者的胎盘绒毛组织,应用半定量逆转录PCR技术(RT-PCR)测定其HLA-E mRNA的表达.结果自然流产与人工流产胎盘绒毛HLA-E mRNA相对表达量分别为0.5385±0.2566和0.5761±0.2531,两者比较无显著性差异(P＞0.05).结论在mRNA水平上,胎盘绒毛HLA-E的表达可能与早期自然流产发病无直接关系.

HLA-E与原因不明习惯性流产的关联研究

目的 :探索HLA E与原因不明习惯性流产的发生是否存在关联。方法 :采用地高辛标记的寡核苷酸探针杂交技术 ,对上海地区 5 3例原因不明习惯性流产病人和 15 6例正常对照进行了HLA E等位基因检测。结果 :在病人和对照组中HLA E 0 10 1均是最常见的等位基因 ,其基因频率分别为 5 0 %和 43.0 9% ,其次是E 0 10 32分别为 2 9.2 5 %和 33 .12 %。E 0 10 31则分别占 2 0 .75 %和 2 3.79% ,HLA E 0 10 2和E 0 10 4在两组标本中均未检出。检出的 3个等位基因在两组之间比较均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :HLA E等位基因多态性与原因不明习惯性流产的发生可能没有直接关联。