Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一

目的：探讨雷公藤红素对ＨＭＣ１细胞表达Ｆａｓ、ＦａｓＬ的影响及与凋亡的关系。方法：用流式细胞仪检测细胞凋亡和Ｆａｓ、ＦａｓＬ的表达。结果：ＨＭＣ１细胞能自发表达Ｆａｓ，不表达ＦａｓＬ。经雷公藤红素作用，Ｆａｓ呈先升后降的变化，ＦａｓＬ低水平表达。Ｆａｓ阳性率下降与凋亡率增加相关。

雷公藤红素诱导人肥大细胞系HMC-1细胞凋亡及与细胞周期的关系

目的:研究雷公藤红素对人肥大细胞系 HMC-1细胞凋亡的诱导作用。方法:HMC-1细胞与雷公藤红素(0.125～1.0μmol/L)共育不同时间,经 DNA 琼脂糖电泳和流式细胞仪 DNA 含量分析。结果:(1)雷公藤红素能有效地诱导 HMC-1细胞凋亡,细胞呈凋亡形态学改变,DNA 琼脂糖电泳出现梯形条带,流式细胞仪分析,在 G_1期峰前出现凋亡峰。(2)凋亡程度随药物浓度增加和作用时间的延长而提高。(3)凋亡率随 S 期细胞比例的下降而升高,二者呈显著负相关(P<0.01)。结论:雷公藤红素可以诱导 HMC-1细胞凋亡,凋亡主要发生在 S期。

交联CD44通过Fas途径促进人肥大细胞白血病HMC-1细胞的凋亡

目的:探讨交联CD44分子对人肥大细胞白血病HMC-1细胞株Fas表达及其介导的细胞凋亡的影响。方法:应用流式细胞术检测HMC-1细胞表面CD44及Fas的表达,并观察透明质酸(native hyaluronan,HA)、低分子质量透明质酸(fragmented hyaluronan,F-HA)处理或抗体交联CD44分子后细胞表面Fas表达的变化,进而检测PI3K、PKC及MAPK信号通路抑制剂、蛋白质合成抑制剂和肌动蛋白聚合抑制剂对CD44分子交联后细胞表面Fas表达的影响,用Northern杂交技术检测交联CD44对Fas mRNA表达的影响,用Annexin V/PI双染法检测交联CD44、HA或F-HA对Fas介导的细胞凋亡的影响。结果:HMC-1细胞高表达CD44而低表达Fas,交联CD44分子显著上调细胞表面Fas的表达(P<0.05),而Fas mRNA转录水平没有明显变化;肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B能抑制CD44上调的Fas表达(P<0.05),所检测细胞信号通路抑制剂和蛋白质合成抑制剂均未能抑制Fas表达的上调(P>0.05);F-HA和交联CD44均能够促进Fas介导的细胞凋亡(P<0.05)。结论:CD44分子可上调HMC-1细胞的Fas表达并放大Fas介导的细胞凋亡,CD44分子可能成为肥大细胞白血病治疗的新靶点。

过表达TRPM8在SCN5A错义突变后对肥大细胞功能的影响

目的探究过表达瞬时受体电位阳离子通道M8(TRPM8)在心脏钠通道基因(SCN5A)错义突变后对肥大细胞功能的影响。方法构建TRPM8基因过表达载体及SCN5A干扰载体并分别转染入人肥大细胞HMC-1中,转染成功后用CCK8检测细胞增殖能力,qPCR、Western blot法检测TRPM8与SCN5A的表达情况,中性红染色计算肥大细胞脱颗粒百分率,比色法测定β-氨基己糖苷酶释放率。结果TRPM8基因过表达及SCN5A干扰载体成功构建;与空白对照组相比,过表达TRPM8与干扰SCN5A后均抑制了HMC-1细胞的增殖能力,过表达TRPM8对HMC-1细胞增殖能力的抑制作用低于干扰SCN5A组(P<0.05);与干扰SCN5A组相比,干扰SCN5A的同时过表达TRPM8后对HMC-1细胞增殖能力的抑制作用有所降低(P<0.05);与空白对照组相比,过表达TRPM8降低HMC-1细胞脱颗粒反应和β-氨基己糖苷酶释放率,干扰SCN5A后增强了HMC-1细胞脱颗粒反应和β-氨基己糖苷酶释放率(P<0.05);与干扰SCN5A后相比,在干扰SCN5A的同时过表达TRPM8可降低HMC-1细胞脱颗粒反应和β-氨基己糖苷酶释放率(P<0.05);干扰SCN5A后可下调HMC-1细胞中TRPM8的表达(P<0.05)。结论TRPM8可以抑制SCN5A错义突变后对肥大细胞的激活作用,并可能通过调控SCN5A来减缓肠易激综合征患者疼痛等不适症状。

肥大细胞在细菌鞭毛蛋白引起的肠T84细胞单层损伤中的作用

目的 探讨细菌鞭毛蛋A对肠黏膜屏障影响及肥大细胞在肠黏膜屏障损伤中作用.方法 在Transwell小室内共同培养T84细胞单层和肥大细胞(HMC-1),模拟肠黏膜屏障,并向培养系统中加入细菌鞭毛蛋白.通过测量不同条件下T84细胞单层的跨上皮电阻(TER)值和辣根过氧化酶(HRP)通过率,分析肠黏膜屏障完整性;使用免疫细胞化学实验检测T84细胞对细菌鞭毛蛋白的摄取;使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测基底层培养基中经T84细胞转运的细菌鞭毛蛋白含量,以及HMC-1细胞分泌的组胺和类胰蛋白酶β2(MCT)的水平.结果 较低浓度(≤8mg/L)的细菌鞭毛蛋白对T84细胞单层的相对TER值以及HRP通过率无显著影响;当细菌鞭毛蛋白浓度>8mg/L,随着细菌鞭毛蛋白浓度的增加T84细胞单层的相对TER值逐渐下降,HRP通过率逐渐增加.免疫细胞化学结果显示,和正常对照组相比,细菌鞭毛蛋白组T84细胞的胞质被染成棕褐色.ELISA结果提示细菌鞭毛蛋白组基底侧细菌鞭毛蛋白吸光度A值明显高于正常对照组,并且各组组胺浓度和MCT水平与各组细菌鞭毛蛋白HRP通过率的结果保持一致.结论 细菌鞭毛蛋白可直接破坏T84细胞单层或经T84细胞摄取并转运到达基底侧,激活HMC-1细胞,使其释放组胺及类胰蛋白酶β2,增强T84细胞单层肠黏膜屏障的损伤.

山柰酚对脂多糖诱导的肥大细胞炎症反应的抑制作用

研究山柰酚对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的HMC-1肥大细胞炎症反应的抑制作用。利用MTT法检测山柰酚对HMC-1细胞的细胞毒性作用,同时确定山柰酚的给药浓度;ELISA检测活化的HMC-1细胞经不同浓度的山柰酚（10、20和40μmol·L-1）作用后组胺、IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的释放量;Western blot检测经不同浓度的山柰酚作用于活化的HMC-1细胞后,胞质中p-IKKβ、IκBα、p-IκBα和胞核中NF-κB（p65）蛋白水平。根据MTT法的实验结果,确定了山柰酚的给药浓度范围为5~40μmol·L-1。山柰酚能够使活化的HMC-1肥大细胞中组胺、IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的释放量显著下降（P〈0.01）。山柰酚作用于LPS诱导的HMC-1细胞后,p-IKKβ、p-IκBα和胞核中NF-κB（p65）蛋白水平会显著下降（P〈0.01）。结果表明,山柰酚对于肥大细胞炎症反应具有显著的抑制效应,它能够抑制IKKβ的活化,抑制IκBα的磷酸化,阻止NF-κB（p65）进入细胞核内,进而影响相关炎症介质的释放。

基于Microtox技术的参麦注射液过敏反应检测及相关物质基础的研究

目的:利用基于发光细菌的Microtox测试技术,对国家药品不良反应监测中心数据库指引的高风险品种——参麦注射液的生物毒性实现定量化表征,初步探索导致其过敏反应的物质基础及临床意义,以期为参麦注射液的质量控制和不良反应风险预警提供新型、快速、灵敏的检测方法和技术平台。方法:(1)应用基于费氏弧菌CS234的Microtox测试体系对6个厂家共计15个批次的参麦注射液市售产品进行测试,得到相应的Microtox测试参数IC50。(2)采用高效液相色谱法对上述参麦注射液中三种代表性人参皂苷Re、Rg1及Rb1进行含量测定,分析IC50与三种人参皂苷及其总含量的相关性。(3)采用肥大细胞脱颗粒模型观察上述参麦注射液和人参皂苷Re对HMC-1细胞组胺及β-氨基己糖苷酶释放的影响。结果:(1)除A公司的参麦注射液无法计算IC50外(最高浓度受试样品的抑制率未达到50%),其余厂家的IC50从46.7%至72.3%不等,且存在显著性差异。(2)各厂家参麦注射液中人参皂苷Re及三种人参皂苷的总含量分别在0.07 mg/ml^0.14 mg/ml以及0.34 mg/ml^0.60 mg/ml范围内,非参数检验显示厂家间含量均存在显著性差异。经Pearson相关性分析显示,各厂家间IC50和人参皂苷Re含量之间存在显著的正相关关系(P=0.001),相关系数为0.823。(3)人参皂苷Re终浓度为0.10 mg/ml时,能显著增加HMC-1细胞上清液中组胺的含量。结论:本测试体系可用IC50定量表征参麦注射液的生物毒性,人参皂苷Re为显著影响IC50的物质之一,且Re在一定剂量下(终浓度0.10 mg/ml)对HMC-1细胞有显著的促组胺释放作用,提示参麦注射液中人参皂苷Re含量控制的必要性。基于费氏弧菌CS234的Microtox测试体系有望成为参麦注射液质量控制及不良反应风险预警的新型检测技术平台,以期最终为临床安全用药提供参考和保障。