HMG-CoA2裂解酶在鼻咽癌组织中表达及其对鼻咽癌细胞增殖、侵袭能力的影响

目的探讨HMG-CoA2裂解酶(HMGCL)在鼻咽癌(NPC)组织中表达及其过表达对鼻咽癌细胞行为学的影响。方法Western blot检测64例鼻咽癌组织和42例正常鼻咽上皮组织(NNE)及5个NPC细胞系(HK-1、CNE1、CNE2、HONE1和HNE-1)和正常鼻咽上皮细胞NP69中HMGCL表达水平;以HK-1细胞为研究对象,构建过表达HMGCL的细胞株;MTT法、集落形成实验、Transwell实验分别检测过表达HMGCL后HK-1细胞增殖、集落形成和迁移侵袭能力。结果HMGCL在NPC和NPC细胞系中普遍低表达(P<0.05),在NNE和NP69细胞中普遍高表达(P<0.05);成功构建了过表达HMGCL的HK-1细胞株,过表达HMGCL后HK-1细胞增殖、集落形成和迁移侵袭能力均显著降低(P<0.05)。结论HMGCL在鼻咽癌组织中低表达可能与鼻咽癌细胞恶性表型有关,为将来寻找抑制鼻咽癌发生进展提供了新的靶标。

大肠埃希氏菌噬菌体swi2裂解系统的表达及协同抑菌活性测定

为了确定大肠埃希氏菌噬菌体swi2裂解系统的穿孔素(holin)与裂解酶(lysin1、lysin2)在裂解宿主菌过程中的协同作用,根据噬菌体swi2裂解系统的基因序列设计引物,搭桥PCR法分别扩增holin-lysin1、holin-lysin2、lysin1-lysin2基因,以pColdTF为载体,构建重组质粒pCold-holin-lysin1、pCold-holin-lysin2、pCold-lysin1-lysin2,在大肠埃希氏菌BL21中诱导表达,并测定各串联蛋白对大肠埃希氏菌BL21的菌内外裂解活性。结果表明,成功构建了噬菌体swi2裂解系统相关基因两两串联的重组质粒,并在原核系统中实现了holin-lysin1、holin-lysin2、lysin1-lysin2蛋白的可溶性表达。lysin1、lysin2具有天然的菌内和菌外裂解活性,而单独的holin未表现出任何抑菌活性;lysin1与lysin2、holin与lysin1之间无协同作用,而holin与lysin2之间存在协同作用,可以显著增强lysin2的菌内外裂解活性(P<0.05)。研究结果证明了lysin1和lysin2在噬菌体swi2增殖后期替代holin完成裂解宿主菌的过程,两者之间不存在协同作用,这将为进一步阐明噬菌体swi2的裂解机制提供参考。

2型糖尿病患者血管并发症与血浆血管性血友病因子裂解酶的关系

目的检测2型糖尿病患者血浆血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)活性,探讨其在糖尿病血管并发症中的意义。方法将74名2型糖尿病患者根据是否合并有血管并发症分为无并发症组(24例)、微血管并发症组(27例)、大血管并发症组(23例)。观察不同组患者血浆vWF-cp活性水平,并与正常对照组(40例)比较。结果2型糖尿病患者血浆vWF-cp活性水平明显低于正常对照组(P<0.05);合并大血管病变组vWF-cp水平明显低于其他糖尿病组(P<0.05)。结论血浆vWF-cp活性水平下降可能是2型糖尿病患者容易形成血栓的另一重要原因。vWF-cp活性异常可能在糖尿病的临床进展和并发症的发生中起重要作用。

β位淀粉样前体蛋白裂解酶2基因敲除斑马鱼动物模型的构建及其初步应用

目的构建β位淀粉样前体蛋白裂解酶2(β-site APP-cleaving enzyme 2,BACE2)基因敲除斑马鱼动物模型并及其初步探索其应用。方法运用CRISPR/Cas9技术,在斑马鱼中设计针对靶点的gRNA,使之诱导靶点突变,经测序鉴定得到突变体。结果BACE2纯合突变体在早期部分无法存活,RT-PCR结果显示BACE2基因在斑马鱼的早期发育中持续表达。结论 BACE2基因敲除的斑马鱼动物模型将为进一步研究BACE2基因在斑马鱼胰腺发育中的作用和针对糖尿病的药物靶点筛选提供有效工具。

胱硫醚-γ-裂解酶产生的H_(2)S在小鼠脑缺血/再灌注损伤中的作用及与RhoA-ROCK_(2)信号通路的关系

目的探讨胱硫醚-γ-裂解酶产生的H_(2)S在脑缺血/再灌注(cerebral ischemia/reperfusion,I/R)损伤中的作用及与RhoA-ROCK_(2)信号通路的关系。方法采用双侧颈总动脉结扎制备小鼠脑缺血/再灌注损伤模型,激光散斑法检测脑血流量,HE染色法观察脑海马组织病理学变化,检测LDH、NSE、RhoA和ROCK_(2)活性及H_(2)S含量和ROCK_(2)蛋白表达。结果H_(2)S合酶CSE底物L-Cys(300 mg·kg^(-1))可明显促进脑I/R小鼠脑血流量的恢复,改善海马组织的病理损伤,抑制血清中LDH活性和脑组织中NSE、RhoA及ROCK_(2)活性的升高,并抑制血清H_(2)S含量的降低和脑组织中ROCK_(2)蛋白表达的增多。但L-Cys上述作用可被CSE合酶抑制剂PPG(50 mg·kg^(-1))明显地减弱;H_(2)S供体NaHS(4.8 mg·kg^(-1))也有与L-Cys相同的上述作用。结论CSE产生的H_(2)S对小鼠脑I/R损伤有保护作用,其作用可能与抑制RhoA-ROCK信号通路及增加脑血流量有关。

TSP2-8和CUB1+2片段对血管性血友病因子裂解酶分泌方向的影响

本研究旨在探讨羧基端TSP2-8和CUB1+2片段是否决定血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)合成后细胞内运输的方向,以了解金属蛋白酶ADAMTS13羧基端结构与功能的关系。利用脂质体转染技术将重组质粒pcDNA3.1-ADAMTS13及pcDNA3.1-delTSP2-8CUB1+2ADAMTS13分别转染犬肾上皮极性细胞MDCK,筛选出阳性细胞克隆后传代铺到中间有特殊分子筛膜的双池培养皿内培养,待细胞生长到无空隙后收集上、下池培养液;通过Western blot检测上、下池培养液中ADAMTS13蛋白表达水平,以对比分析ADAMTS13蛋白在极性细胞内的分泌方向。结果表明,稳定表达野生型ADAMTS13的MDCK细胞组,在分子筛膜的上池培养液中检测到ADAMTS13蛋白,而表达缺失TSP2-8CUB1+2区域ADAMTS13的细胞组,在分子膜的上、下池培养液中均检测到ADAMTS13重组蛋白。结论:金属蛋白酶ADAMTS13的分泌是有极性的,且羧基端TSP2-8和CUB1+2结构域与ADAMTS13合成后细胞内的运输方向密切相关。

精氨琥珀酸裂解酶上调乙型肝炎病毒表面抗原启动子Ⅰ的研究

目的 了解精氨琥珀酸裂解酶 (ASL)与乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原启动子 Ⅰ (SpⅠ )的关系 ,研究精氨琥珀酸裂解酶与SPI在HBV致病的分子生物学机制中的作用。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)扩增精氨琥珀酸裂解酶编码基因。以T A克隆法 ,将ASL基因片段连入载体pGEM T。将获得的质粒pGEM T ASL ,与报告质粒pcDNA3 .1(-)分别用KpnI和XhoI双酶切后构建ASL表达载体pcDNA3 .1(-) ASL ,将重组表达载体pcDNA3 .1(-) ASL和pCAT3 SpⅠ瞬时转染HepG2细胞 ,同时转染pCAT3 basic入HepG2细胞 ,作为阴性对照 ,48h后收获细胞。用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞中报告基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性 ,以了解ASL对SpI转录活性的调节作用。结果 构建的真核表达载体pcDNA3 .1(-) ASL经过酶切鉴定和测序证实正确。在真核表达载体pcDNA3 .1(-) ASL和pCAT3 SpI共转染的HepG2细胞中 ,CAT表达活性是CAT3空载体的 3 .3倍 ,是pCAT3 SpⅠ的1.45倍。结论 精氨琥珀酸裂解酶可以上调SpⅠ启动子的活性 ,促进表面抗原基因的表达。

外源性硫化氢对嗜铬细胞瘤细胞β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的观察外源性硫化氢(H2S)对嗜铬细胞瘤细胞(PC12)β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)表达的影响,并探讨可能涉及的细胞信号机制。方法用不同浓度的硫氢化钠(NaHS)处理体外培养的PC12细胞,利用RT-PCR和Western blot法检测细胞内BACE1mRNA及蛋白表达;继以LY294002和PD98059分别阻断磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3-K/Ak)t及丝裂酶原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2(MAPK/ERK1/2)通路,Western blot法检测其对NaHS诱导的通路下游蛋白Akt1和ERK1/2磷酸化的影响及其对BACE1蛋白表达变化的调节;ELISA法检测细胞培养液中Aβ42水平的变化。结果 NaHS在实验浓度范围内呈剂量依赖性下调BACE1mRNA及蛋白表达,200μmol/L时最明显,各NaHS组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);LY294002抑制NaHS诱导的Akt1蛋白磷酸化,削弱NaHS对BACE1蛋白的下调作用,其表达在LY294002预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);而PD98059虽能抑制NaHS导致的ERK1/2蛋白磷酸化,但对其调节BACE1蛋白表达无影响,PD98059预处理组与NaHS200μmol/L组相比,差异无统计学意义(P>0.05);不同处理条件下的Aβ42表达与BACE1变化趋势基本一致。结论外源性H2S下调PC12细胞BACE1表达,其机制可能与PI3-K/Akt信号通路的激活有关,而与MAPK/ERK1/2通路无关。

大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析

为研究大肠杆菌O157Stx噬菌体编码的裂解酶(内溶素)对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用,克隆表达了大肠杆菌O157Stx噬菌体裂解酶,并检测其裂解作用和裂菌谱。利用PCR方法扩增大肠杆菌O157Min27株中Stx2噬菌体裂解酶基因(R基因),构建表达质粒pET28a(+)-lysEC1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。重组质粒在BL21中获得了高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,经His-trapTM亲和层析柱纯化后,获得的重组LysEC1的纯度大于97%。体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶LysEC1对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用,这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向。

一种L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒的构建及高效表达

目的:拟通过构建人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒,并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化表达产物,从而获得重组蛋氨酸裂解酶。方法:PCR法从人阴道毛滴虫的基因组中获得L-蛋氨酸γ-裂解酶获得L-蛋氨酸γ-裂解酶基因片段,并克隆至pGEX4T-2质粒,获得重组质粒,转化至大肠杆菌DH5α中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下,实现高效表达,表达产物经亲和层析纯化获得重组L-蛋氨酸γ-裂解酶。结果:表达产物进行SDS-PAGE检测,结果表明在相对分子质量68000处出现高浓度的GST融合蛋白,相对分子质量与预期大小相符;薄层扫描显示重组蛋白占总菌量的33.6%。结论:人阴道毛滴虫的L-蛋氨酸γ-裂解酶质粒构建成功,并成功地获得高效表达。

基质金属蛋白酶-2在乳腺癌中的表达及与侵袭、转移的关系

[目的]探讨乳腺癌细胞基质金属蛋白酶-2的表达及其与侵袭、转移的关系.[方法]免疫组织化学方法检测60例乳腺癌患者癌组织中MMP-2表达.[结果]MMP-2的表达在乳腺癌细胞明显高于正常乳腺细胞(P<0.01);淋巴结转移组明显高于非淋巴结转移组(P<0.01);在中、低分化组明显高于高分化组(P.<0.01).但与组织学类型无关(P<0.05).[结果]乳腺癌的MMP-2的表达与其侵袭、转移可能相关.

外周血PLA2R抗体、25(OH)D_(3)、ADAMTS13与原发性膜性肾病患者病情、肾功能损伤的关系

目的探讨原发性膜性肾病患者外周血M型磷脂酶A2受体(PLA2R)抗体、25羟维生素D_(3)[25(OH)D_(3)]、血管性血友病因子裂解酶13(ADAMTS13)与其病情程度及肾功能损伤的关系。方法选取2021年1月至2023年1月该院收治的122例原发性膜性肾病患者作为研究对象,所有患者均经肾穿刺活检病理检查确诊,根据病理分期结果分为1期组(55例)、2期组(24例)、3期组(43例)。另选同期于本院体检的40例健康者作为健康组。所有患者均随访6个月,并评价患者肾功能情况,患者24 h尿蛋白量减少≥50%、水肿症状减轻或消失,纳入良好组,其余纳入不良组。比较1期组、2期组、3期组、健康组研究指标[PLA2R抗体、25(OH)D_(3)、ADAMTS13活性]、肾功能指标(24 h尿蛋白、ALB)水平。采用Pearson相关分析PLA2R抗体、25(OH)D_(3)水平、ADAMTS13活性与24 h尿蛋白、ALB水平的关系。比较良好组与不良组的PLA2R抗体、25(OH)D_(3)水平、ADAMTS13活性。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析PLA2R抗体、25(OH)D_(3)、ADAMTS13单独及3项指标联合检测对原发性膜性肾病患者肾功能损伤的预测价值。结果PLA2R抗体、24 h尿蛋白水平为3期组>2期组>1期组>健康组,且任意两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。25(OH)D_(3)水平、ADAMTS13活性、ALB水平比较,3期组<2期组<1期组<健康组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,PLA2R抗体水平与24 h尿蛋白水平呈正相关(r=0.620,P<0.05);25(OH)D_(3)水平、ADAMTS13活性与24 h尿蛋白水平均呈负相关(r=-0.625、-0.607,P<0.05);PLA2R抗体水平与ALB水平呈负相关(r=-0.591,P<0.05);25(OH)D_(3)水平、ADAMTS13活性与ALB水平均呈正相关(r=0.742、0.899,P<0.05)。良好组患者63例,不良组患者59例。良好组PLA2R抗体水平低于不良组,而25(OH)D_(3)水平、ADAMTS13活性均高于不良组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,PLA2R抗体、25(OH)D_(3)、ADAMTS13单独检测预测原发性膜性肾病患者肾功能损伤的曲线下面积分别为0.831、0.836、0.713,均低于3项指标联合检测预测原发性膜性肾病患者肾功能损伤的0.860(P<0.05)。结论原发性膜性肾病患者外周血PLA2R抗体水平会随着患者疾病恶化而逐渐升高,而25(OH)D_(3)水平、ADAMTS13活性会随病情加重而逐渐降低,且3项指标联合检测对原发性膜性肾病患者肾功能损伤有较高预测价值。

褐飞虱刺吸诱导的水稻一些防御性酶活性的变化

褐飞虱刺吸导致稻株体内丙二醛含量迅速上升,表明褐飞虱刺吸引起了水稻植株膜脂的过氧化;抗虫和感虫品种植株体内脂氧合酶(LOX)、脂氢过氧化物裂解酶(HPL)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性均显著升高;而过氧化氢酶(CAT)活性在抗虫品种稻株体内明显受抑制,H2O2含量提高,但在感虫品种植株体内CAT的活性略有提高,H2O2含量略有下降。对抗虫品种植株不同器官的测定结果表明,褐飞虱刺吸对PAL和H2O2的影响是系统性的,而对LOX的影响则仅局限于褐飞虱刺吸部位的茎杆中。

克劳氏芽孢杆菌S-4菌株固态发酵产碱性果胶酶

对克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)S 4菌株产碱性果胶酶的固态发酵条件进行了优化,并对酶的部分性质进行了分析,结果表明,以甜菜粕为碳源和酶的诱导物,酵母膏和麸皮作氮源较适宜。固体培养基的组成:甜菜粕5 0g ,麸皮2 0 g ,KH2 PO40 0 15g ,MgSO4·7H2 O 0 2 5g ,Na2 CO3 0 12g ,水2 0mL ;培养温度4 0℃;发酵时间72h ;产酶率可达2 30 0u/g(甜菜粕)。该酶具有果胶水解酶和果胶裂解酶的活性,在pH 10 5 ,反应温度6 0℃时酶活力最高,在pH9 5～11 0范围内,温度4 0℃以下较稳定。1 0mmol/L的Ca2 + 、Tween 80和SDS对该酶有明显的激活作用,Mn2 + 、Cu2 + 、Zn2 + 对其有强烈的抑制作用。

内源性硫化氢体系与低O_2高CO_2性肺动脉高压的相关性研究

目的:研究低O2高CO2性肺动脉高压(HHPH)时大鼠肺组织内硫化氢(H2S)体系变化的改变及相关性,并探讨其机制。方法:20只SD大鼠随机分为正常对照组(C组)和低O2高CO2组(HH组)(n=10)。监测其血流动力学变化,光镜观察肺细小动脉管壁面积/管总面积比值(WA/TA),测右心室/左心室+室间隔(RV/LV+SP)比值。原位缺口末端标记法(TUNEL法)观测肺细小动脉凋亡情况,并计算凋亡指数(AI),免疫组化检测肺细小动脉Bcl-2、Bax蛋白表达。敏感硫电极法测定血浆H2S含量及肺组织匀浆胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)活性变化。RT-PCR法测定肺组织中CSE基因表达。结果:HH组肺平均动脉压(mPAP)、WA/TA、RV/LV+SP明显高于C组(P<0.05或P<0.01)。与C组相比,HH组AI显著下降(P<0.01),Bcl-2表达加强,Bax减弱,Bax/Bcl-2比值上升(均P<0.01)。血浆H2S含量、肺组织匀浆CSE活性、肺组织CSE基因表达水平HH组明显低于C组(P<0.01)。血浆H2S、肺组织CSE活性、肺组织CSE mRNA相对含量与mPAP,Bcl-2/Bax比值均呈显著负相关,与AI呈显著正相关。结论:H2S/CSE体系与低O2高CO2性肺动脉高压关系密切,HHPH时H2S/CSE体系的明显受抑,可使Bcl-2/Bax比值升高,肺动脉平滑肌细胞凋亡减少,促进肺血管重建和肺动脉高压的形成。

内源性胱硫脒-γ-裂解酶/硫化氢调控HepG2细胞凋亡(英文)

探讨内源性胱硫脒-γ-裂解酶/硫化氢(CSE/H2S)对人肝癌HepG2细胞凋亡的调控作用。采用MTT法和台盼蓝染色法检测细胞增殖;亚甲基蓝法检测细胞内源性H2S的产生;PI/Hoechst双染法检测细胞凋亡;荧光探针法检测细胞内超氧阴离子及ROS水平;OxiSelect Total Glutathione Assay试剂盒检测细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)水平;Western blotting检测activated-caspase 3、p-AKT和Nrf2表达。结果显示,CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(PAG)和CSE siRNA可明显降低细胞内H2S水平,可呈剂量和时间依赖性地抑制HepG2细胞增殖。PAG和CSE siRNA均可明显增加HepG2细胞凋亡率以及细胞内超氧阴离子和ROS的水平,降低细胞内GSH水平。CSE siRNA引起的ROS水平升高及GSH水平降低可被重组质粒pcDNA 3.1/myc-His()-CSE恢复。CSE siRNA可促进caspase 3的活化,但不会影响p-AKT及Nrf2蛋白的表达。结果表明,内源性CSE/H2S系统可通过氧化应激调控HepG2细胞的增殖及凋亡。

可溶性人基质裂解素2与肺源性心脏病患者心肌酶学指标、炎性指标及传统心血管危险因素的相关性研究

目的探讨可溶性人基质裂解素2(sST2)与肺源性心脏病(肺心病)患者心肌酶学指标、炎性指标及传统心血管危险因素的相关性。方法选取昆明市第三人民医院2016-01-01—2016-03-31收治的肺心病患者51例作为病例组,另选取同期体检健康者27例作为对照组。比较两组受试者心肌酶学指标、炎性指标、传统心血管危险因素及氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、sST2水平,并分析sST2水平与心肌酶学指标、炎性指标及传统心血管危险因素的相关性。结果两组受试者肌酸激酶(CK)、肌红蛋白(Mb)、心肌肌钙蛋白T(c Tn T)水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);病例组患者肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、降钙素原(PCT)、NT-proBNP、sST2水平高于对照组(P<0.05)。两组受试者收缩压、舒张压、平均动脉压、入院时随机血糖、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA_(1c))及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);病例组患者总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)水平低于对照组(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,sST2与CK-MB(r=0.582)、Mb(r=0.517)、NT-proBNP(r=0.453)呈正相关,与TC(r=-0.559)呈负相关(P<0.05)。结论 sST2与肺心病患者CK-MB、Mb、NT-proBNP、TC有关。

COX-2特异性抑制剂罗非昔布对阿尔茨海默病Aβ沉积的影响

本文应用免疫荧光、Western blot及ELISA等实验方法检测COX-2特异性抑制剂罗非昔布对阿尔茨海默病Aβ沉积的影响。实验分为三组,即对照组、AD模型组以及罗非昔布处理组。实验结果发现,与对照组小鼠相比,APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积及老年斑的数量增多、体积增大,Aβ1-40和Aβ1-42的含量增加,β-分泌酶和γ-分泌酶(包括BACE1、PS1、PS2、NCT)表达升高,并且小鼠脑内COX-2表达升高;小鼠经罗非昔布干预后,脑内Aβ沉积和老年斑数量减少、APP裂解酶和COX-2表达水平较AD模型组明显降低,以上结果说明COX-2特异性抑制剂罗非昔布可能通过抑制COX-2从而间接降低β-分泌酶和γ-分泌酶的活性,下调PS1、PS2、BACE1、NCT等分泌酶的表达,最终减少Aβ沉积和老年斑的形成,缓解阿尔茨海默病的发生与发展。

受体相互作用蛋白2基因对结直肠癌肿瘤细胞侵袭及转移的作用机制研究

目的探讨受体相互作用蛋白2(receptor interacting protein 2,RIP2)基因对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)肿瘤细胞侵袭、转移的影响及其作用机制。方法利用免疫组化染色(IHC)法检测CRC组织及癌旁正常组织中RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B的表达。分析患者病理情况、RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B的关联性;利用RNAi技术抑制CRC细胞株HCT116中RIP2的表达,比较转染前后肿瘤细胞的迁移能力。结果 CRC组细胞中RIP2、基质裂解蛋白和明胶酶B的表达明显高于正常对照组(P <0. 05); RIP2的表达与CRC细胞的浸润深度和淋巴结的转移程度有明显相关性(P <0. 05); CRC肿瘤细胞中RIP2、基质裂解蛋白、明胶酶B三者表达均呈正相关(P <0. 05);选择性抑制RIP2的表达后,肿瘤细胞的迁移能力明显降低,且基质裂解蛋白和明胶酶B的表达均明显降低。结论 CRC细胞中的RIP2能够通过上调基质裂解蛋白和明胶酶B的表达,提高CRC细胞的侵袭、转移能力。

猪链球菌2型噬菌体裂解酶催化域A5的关键氨基酸位点的鉴定

为了鉴定猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)噬菌体裂解酶(Ly ACCG/Ly ACC)催化域A5的关键氨基酸位点,本研究利用NCBI、Pfam和Uniport数据库,对催化域A5的氨基酸序列中的各位点的保守性进行了比对分析;以噬菌体SMP基因组为模板,PCR扩增lyacc基因,测序分析后构建原核表达质粒p SJ2-lyacc;以质粒p SJ2-lyacc为模板,通过PCR扩增的方法将催化域A5中3个高度保守的氨基酸位点(30位的天冬氨酸/D30、53位的苏氨酸/T53和95位的甘氨酸/G95)的密码子分别定点突变为丙氨酸(A)的密码子,经测序确证后将突变体质粒p SJ2-lyacc/D30A、p SJ2-lyacc/T53A和p SJ2-lyacc/G95A分别转化BL21(DE3)感受态细胞,同时将质粒p SJ2-lyacc作为对照平行转化,用IPTG于27℃诱导表达,菌体重悬后超声裂解,上清液过滤,获得的蛋白粗提液经SDS-PAGE分析,表明重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的分子质量均约为30 ku;将重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的蛋白粗提液用于平板裂解试验,结果显示,原核表达的重组Ly ACC的裂菌圈直径为2.2 cm;突变体G95A的裂菌圈直径仅为1.4 cm,裂菌活性部分降低;突变体D30A和T53A的裂菌圈消失,彻底失去裂菌活性。上述结果表明,D30和T53是Ly ACC的关键氨基酸位点。