高迁移率蛋白A2基因真核表达载体构建与表达鉴定

目的:构建高迁移率蛋白A2(HMGA2)基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,为进一步研究HMGA2基因功能奠定理论基础。方法:采用RT-PCR方法从人乳腺上皮HBL-100细胞中扩增HMGA2基因全长cDNA,扩增产物经双酶切及凝胶回收后,直接克隆至黄绿色荧光真核表达载体YFP-C1中,构建YFP-C1-HMGA2重组质粒。将YFP-C1-HMGA2真核表达载体转染到人前列腺癌PC3细胞中,通过RT-PCR方法验证所构建的真核表达质粒YFP-C1-HMGA2的正确性。结果:RT-PCR获得长度为351bp的HMGA2全长cDNA,经YFP-C1真核表达载体克隆、酶切鉴定及测序分析,测序结果示基因序列与GenBank序列一致,证实真核表达质粒YFP-C1-HMGA2构建成功,并且能够在真核细胞中表达。结论:成功克隆了HMGA2基因,构建了YFP-C1-HMGA2重组质粒。

携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡

背景:慢病毒可以感染分裂及非分裂细胞,对于较难转染的原代卵巢颗粒细胞,慢病毒能否成功进行感染?目的:探讨携带bcl-2基因的慢病毒感染原代人卵巢颗粒细胞的效率及对细胞凋亡的影响。方法:利用分子生物学技术,构建携带bcl-2基因慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(10,50,100,200,400)感染人卵巢原代颗粒细胞,感染24,48,72,96h后观察感染效率及细胞增殖情况,同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,利用反转录聚合酶链反应检测bcl-2基因的转录情况。结果与结论:原代培养人卵巢颗粒细胞24h即贴壁,集落样生长,呈多角形或梭形;当感染复数为100时,细胞的形态和生长不受影响,且感染效率较高,感染后72h达高峰,其在颗粒细胞中的阳性率达60%;携带bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞,可以过度分泌Bcl-2蛋白,能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。