干扰HMGB1基因表达对食管鳞癌细胞侵袭迁移及放射敏感性的影响

目的:探讨干扰HMGB1基因对X线照射后食管鳞癌细胞增殖活性、存活能力及侵袭、迁移能力的影响及其机制。方法:构建含有HMGB1 shRNA的慢病毒载体并转染人食管鳞癌EC9706细胞(HMGB1 shRNA组),并以转染阴性序列的细胞为对照组,两组均设置X射线照射和未照射2个亚组。采用Western blot法评估HMGB1基因的干扰效果;MTS法和集落形成实验分别检测食管鳞癌EC9706细胞的增殖活性和存活能力;划痕实验和Transwell小室实验分别检测干扰HMGB1基因对EC9706细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术和Western blot分别检测照射后各组的细胞凋亡率及上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达。结果:与阴性对照组比较,Western blot结果显示干扰HMGB1基因明显降低了HMGB1蛋白的表达(P<0.01),MTS法检测结果显示X射线照射后干扰HMGB1显著抑制了食管鳞癌细胞的增殖水平(P<0.05),集落形成实验结果显示HMGB1 shRNA组细胞的放射敏感性明显增加(P<0.01)。划痕实验结果显示,X射线照射后HMGB1 shRNA组细胞24 h的划痕愈合率为(20.78±4.38)%,低于阴性对照组的(39.02±3.25)%(P<0.01)。Transwell实验结果显示X射线照射后HMGB1 shRNA组细胞在3.5 h的迁移细胞数为(67.00±16.56)个,低于阴性对照组的(194.00±19.74)个(P<0.01)。流式细胞术结果显示,X射线照射后阴性对照组细胞凋亡率为(13.64±1.24)%,HMGB1 shRNA组细胞凋亡率为(20.67±1.38)%;与阴性对照组比较,X射线照射后HMGB1 shRNA组细胞E-cadherin表达显著增加,而Ncadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达明显降低(均为P<0.01)。结论:干扰食管鳞癌细胞中HMGB1基因的表达后经X射线照射,降低了肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移水平和存活能力,诱导了细胞凋亡,增加了放射敏感性,并调控EMT相关蛋白的表达。

人脑胶质瘤组织中HMGB1基因的表达及其意义

目的通过检测人脑胶质瘤组织中HMGB1基因的表达水平,探讨其与胶质瘤发生发展的关系。方法采用荧光实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法,检测了42例人脑胶质瘤组织和20例正常脑组织中HMGB1 mRNA表达水平,分析其与胶质瘤的关系。结果 HMGB1 mRNA在胶质瘤组、Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组、Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组及对照组中的表达量分别为21.460%±3.185%、24.300%±6.673%、19.710%±3.179%、7.616%±1.449%。统计显示HMGB1 mRNA表达水平在胶质瘤组明显高于对照组(P<0.05),且在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组及Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组中均明显高于对照组(P<0.05),但HMGB1 mRNA在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组与Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组中的表达水平无显著差异(P>0.05)。结论 HMGB1基因在人脑胶质瘤组织中有高表达,说明HMGB1基因与胶质瘤的发生、发展过程密切相关。

HMGB1基因对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)基因对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的影响及作用机制。方法:培养人血管内皮细胞,实验分为NG组(5.5 mmol/L葡萄糖处理)、HG组(33.3 mmol/L葡萄糖处理)、HG+si-NC组(转染si RNA阴性对照及33.3 mmol/L葡萄糖处理)和HG+si-HMGB1组(转染HMGB1 si RNA及33.3 mmol/L葡萄糖处理)。比较各组细胞HMGB1、p65和IκB-α蛋白表达,细胞活力、氧化应激及炎症反应水平差异。结果:与NG组比,HG组HMGB1 mRNA和蛋白表达升高,细胞活力降低,LDH和ROS升高,SOD降低,ICAM-1、MCP-1和IL-6水平升高,p65表达上调,IκB-α表达下调(P<0.05)。与HG+si-NC组比,HG+si-HMGB1组HMGB1 mRNA和蛋白的表达降低,细胞活力升高,LDH和ROS降低,SOD升高,ICAM-1、MCP-1和IL-6降低,p65表达下调,IκB-α表达上调(P<0.05)。结论:抑制HMGB1表达能提高血管内皮细胞的活力,减轻氧化损伤及炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关。

HMGB1基因多态性与肺结核易感性的关系

目的探讨湖北地区HMGB1基因多态性位点与肺结核易感性的关系。方法采用PCR产物直接测序法,对278例肺结核患者(结核病组)和225例健康对照者的HMGB1基因的3个SNP位点(rs1045411、rs2249825和rs1412125)多态性进行分析,并分析HMGB1各位点等位基因、基因型和单体型与肺结核易感性的相关性。结果HMGB1基因各位点等位基因与基因型在结核组和对照组中的分布差异均无统计学意义(均P>0.05),且各位点在超显性、显性、隐性3种遗传模式下与肺结核易感性相关性无统计学意义(均P>0.05)。HMGB1基因位点rs1045411-rs2249825-rs1412125单体型ACC与增加结核病风险存在强关联(OR=2.044,95%CI:1.220~3.425,P<0.01)。结论HMGB1基因ACC单体型可能与中国湖北地区汉族人群肺结核易感性显著相关。

HMGB1基因与儿童疾病的研究进展

高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)基因位于13q12染色体上,在各种组织细胞中普遍表达,编码的非组蛋白染色体结合蛋白调节转录,并参与DNA的修复,在炎症、细胞分化和肿瘤细胞迁移等过程中发挥重要作用,已成为多种疾病有价值的生物标志物。近年来,越来越多的研究发现该基因与儿童多种疾病密切相关,如呼吸系统疾病、消化系统疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病等,该文就HMGB1基因与儿童疾病的研究进展进行综述。

人HMGB1基因的原核表达、产物纯化及活性鉴定

目的 构建人高迁移率族蛋白 1(HMGB1)编码基因的表达载体 ,获得纯化的重组蛋白 ,研究其生物学功能。方法 通过RT PCR方法扩增出人HMGB1的编码基因 ,克隆于载体pGEM Teasy,再亚克隆于表达载体pGEX4T 2 ,经IPTG诱导可表达相对分子质量 (Mr)约 5 6× 10 3的融合蛋白GST HMGB1。经用GSTrapFF蛋白纯化柱和凝血酶行柱上酶切 ,得到纯化的重组蛋白HMGB1,用培养的人单核细胞系THP1检测蛋白活性。结果 构建了融合蛋白GST HMGB1的重组表达质粒 ,获得了Mr 约为 30× 10 3的纯化蛋白产物。该蛋白能刺激THP1细胞产生TNF α ,并能明显诱导THP1细胞的凋亡。结论 获得了纯化的人HMGB1原核表达产物 ,对研究其在脓毒症中的生物学功能具有重要的意义。

RNA干扰HMGB1基因对食管鳞癌细胞X线照射后增殖与迁移能力影响

目的RNAi技术干扰人食管鳞癌细胞中HMGB1基因表达,观察X线照射后细胞增殖活性、迁移和存活能力及细胞周期分布.方法RT-PCR和Western blot法检测HMGB1 mRNA和蛋白表达;分别采用MTS和Transwell方法检测食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30细胞增殖活性和迁移能力;克隆形成实验检测各组细胞的存活能力;流式细胞术检测照射后各组的细胞周期分布.结果照射组ECA109、KYSE30细胞中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平较未照射组明显增加(P<0.05),且存在剂量-效应和时间-效应关系;MTS结果显示食管鳞癌细胞的增殖水平在照射后不同时间点均明显降低(P<0.01);HMGB1沉默组细胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组和NC组(P<0.01);克隆形成实验结果显示HMGB1表达降低后,肿瘤细胞的放射敏感性明显增加(P<0.01);Tanswell侵袭小室模型检测显示照射后4 h沉默组穿膜细胞数明显降低(P<0.01),且沉默组G0/G1期比例明显高于对照组和NC组,S期比例显著低于其他组,照射后这种趋势更明显(P<0.01).结论RNAi干扰技术降低食管鳞癌细胞中HMGB1的表达,降低了细胞增殖和迁移能力,通过诱导照射后G0/G1期阻滞增加了放射敏感性.

与疾病相关的HMGB1基因多态性研究进展

高迁移率族蛋白B1(HMGB1)由HMGB1基因编码产生,是广泛存在于细胞核内且高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白,其在真核细胞DNA复制和修复中发挥重要作用.分泌或释放到胞外的HMGB1作为一种迟发型炎症介质,在脓毒血症、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肝脏相关疾病等方面介导炎症反应.近年来,对HMGB1基因多态性的研究为进一步明确疾病的发病机制提供了理论基础,由此可对疾病易患性进行早期预测,从而进行早期干预,为疾病的精准预防和治疗奠定基础.就其与临床疾病易感性和预后的相关性研究作一综述.

HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562／A02细胞凋亡增敏作用的研究

目的探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）基因沉默对白血病细胞耐药逆转的作用。方法将HMGB1基因特异性干扰RNA（HMGB1 siRNA）导入K562／A02细胞中，通过Western blot和RT—PCR方法检测HMGB1基因在转染前后的表达；WST8法检测阿霉素（ADM）对转染前后K562／A02细胞的半数抑制浓度（IC50）；流式细胞术检测凋亡细胞百分率；Western blot检测线粒体促凋亡蛋白Smac／DIABLO的释放：采用caspase活性定量检测试剂盒分析caspase-3的活性。结果①与未经处理的K562／A02细胞组相比，转染HMGB1 siRNA的K562／A02细胞组HMGB1 mRNA和蛋白水平分别下降86％和71％；②HMGB1基因沉默使K562／A02细胞对ADM的药物敏感性增强，其IC50值从转染前的（4．83±0.08）μg／ml降低到（1．33±0．10）μg／ml，并在ADM浓度为1μg／ml和5μg／ml时，细胞凋亡百分率分别增加27％、32％；③HMGB1基因沉默可促进ADM所致Smac／DIABLO从线粒体向胞浆释放。并增加caspase-3的活性。结论HMGB1基因沉默能明显增加K562／A02细胞对ADM的敏感性，逆转K562／A02细胞对ADM耐药。

HMGB1 siRNA干扰对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响

目的:采用siRNA技术干扰人食管鳞癌细胞中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)基因表达,观察经X射线照射后细胞增殖活性、存活能力及细胞凋亡率的变化。方法:针对HMGB1 mRNA序列,设计合成有效的干扰序列HMGB1 siRNA,并转染食管鳞癌KYSE30细胞,同时设置转染阴性对照序列的阴性对照组以及未进行转染的空白对照组。采用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot法检测各组细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达;分别用MTS比色、克隆形成实验、流式细胞术和Western blot法检测HMGB1siRNA干扰对食管鳞癌细胞KYSE30细胞的增殖活力、存活能力、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响。结果:HMGB1 siRNA干扰后,KYSE30细胞HMGB1 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P均<0.01);MTS数据显示HMGB1 siRNA干扰后经X射线照射显著抑制了食管鳞癌细胞的增殖水平(与空白对照组和阴性对照组比较,P<0.05);克隆形成实验结果显示空白对照组、阴性对照组、HMGB1 siRNA组的D0值分别为2.57、2.54、1.55 Gy;Dq值分别为1.69、1.65、1.30 Gy;SF2值分别为0.27、0.27、0.13;外推数N值分别为1.93、1.91、2.31;X射线照射后HMGB1 siRNA组肿瘤细胞的凋亡率明显增加,同时bcl-2蛋白表达显著降低,而bax、caspase-3蛋白的表达明显增加(与空白对照组和阴性对照组比较,P<0.01)。结论:siRNA干扰技术可用来抑制食管鳞癌细胞中HMGB1基因的表达,联合X射线照射降低了肿瘤细胞的增殖水平和存活能力,诱导了细胞凋亡,增加了放射敏感性,该作用可能与调控bcl-2、bax和caspase-3基因表达有关。

HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建

目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株,为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础。方法:以Jurkat细胞基因组为模板,PCR扩增3'端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),均将其连入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5a。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆,然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒,成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1～8号质粒)。利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞,48小时后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选,20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序,依次命名为NEO细胞和1～8号细胞)。通过检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1)。结果:HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒。8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致。HMGB1-T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配。成功构建了不同长度的3'端固定的pGL3-HMGB1-luc报告基因。pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc稳定转染至Jurkat细胞后,成功构建了NEO细胞和稳定细胞株HJ1～8,其荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490。结论:构建的HMGB1调控序列报告基因和HJ稳定细胞株为找寻有意义的HMGB1调控区域,以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定了基础。

高迁移率族蛋白1基因多态性与少儿过敏性紫癜肾炎的相关性分析

目的:分析湖北十堰地区高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因多态性与小儿过敏性紫癜肾炎(HSPN)的关系。方法:采用PCR产物直接测序法,检测分析278例过敏性紫癜肾炎少儿(HSPN组)和225例健康对照儿童(对照组)的HMGB1基因多态性及遗传平衡;比较各基因型在不同遗传模式下分布的组间差异和各等位基因,基因型和单体型组间分布差异及其与HSPN的相关性。结果:测序检测到HMGB1基因3个多态性位点rs1045411、rs2249825、rs1412125,其基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡,各基因型不同遗传模式(超显性、显性、隐性)在HSPN组和对照组分布差异无统计学意义(P>0.05);HMGB1等位基因和基因型在对照组与HSPN组差异亦无统计学意义(P>0.05);只有各基因位点单体型ACC在两组间差异有统计学意义(P<0.05),且与增加HSPN风险存在强关联(OR=2.044,95%CI=1.220-3.425,P<0.01)。结论:HMGB1基因ACC单体型可能与中国十堰地区汉族人群HSPN易感性相关。