重组人HMGN2多克隆抗体的制备及应用

目的制备人高迁移率非组蛋白N2(HMGN2)多克隆抗体,并用于HMGN2的亚细胞定位分析。方法提取人淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)总RNA,应用RT-PCR从其总RNA中分离HMGN2cDNA,以pGEX-1λT为载体,构建HMGN2基因大肠杆菌表达载体。应用GST亲合层析柱分离GST-HMGN2融合蛋白,将此融合蛋白免疫新西兰兔,获得抗血清经正辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化。用ELISA法检测HMGN2抗体,免疫细胞化学染色法分析HMGN2的亚细胞分布。结果经酶切产物电泳分析和DNA序列测定证明成功构建出HMGN2基因重组原核表达载体pGEX-1λT-HMGN2。转化大肠杆菌经异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得相对分子质量约35×103的GST-HMGN2融合蛋白。该融合蛋白免疫所得免疫血清经ELISA检测显示获得滴度为1∶2000的较高效价的兔抗人HMGN2多克隆抗体。并应用此抗体对THP-1细胞进行的免疫细胞化学染色显示,经LPS刺激后除细胞核外,胞浆亦明显着色。而且用ELISA法在细胞培养液亦检测到HMGN2。结论本实验成功制备出HMGN2特异多克隆抗体,免疫细胞化学分析初步证明在LPS刺激下HMGN2不仅分布于单核吞噬细胞核,还分布于细胞浆,并可释放到细胞外。