克雷伯氏肺炎杆菌群体感应系统缺失对合成2,3-丁二醇的影响

通过同源重组技术敲除克雷伯氏肺炎杆菌的luxS基因,使其群体感应系统失活,研究突变株在2,3-丁二醇发酵培养基中的生长状况及对2,3-丁二醇合成的影响;同时检测对其他副产物合成的影响,通过对野生株和luxS突变株发酵合成2,3-丁二醇的结果进行研究发现,与野生株相比,失去了群体感应功能的luxS突变株利用同样质量浓度的葡萄糖合成2,3-丁二醇的能力提高了47.75%,同时琥珀酸、乳酸和乙醇等主要副产物的质量浓度大幅降低。

siHybrids分子对耐药肺炎克雷伯菌kpc-2抑制作用研究

目的:本研究采用RNA干扰技术和合成小分子抑制剂的方法,研究si Hybrids分子对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯杆菌耐药性的影响。方法:通过对临床分离的48株肺炎克雷伯杆菌进行药敏实验,初步筛选并收集了耐碳青霉烯类抗生素的菌株;进一步利用PCR检测,筛选出携带碳青霉烯酶基因kpc-2的耐药株。利用si Hybrids技术,针对kpc-2设计合成si Hybrids杂合分子,对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因kpc-2进行特异性沉默后,通过荧光定量PCR实验检测si Hybrids沉默靶基因kpc-2的体外表达水平,并通过联合抑菌实验验证si Hybrids分子提高抗生素抗菌活性乃至逆转细菌耐药性的效果。结果:合成的小分子siHybrids可以使耐药肺炎克雷伯杆菌kpc-2基因的表达下调,并且与碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南、厄他培南分别联合使用,可使肺炎克雷伯杆菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南由耐药转为敏感。结论:si Hybrids可以特异地抑制耐药肺炎克雷伯杆菌kpc-2基因的表达,通过干扰产碳青霉烯酶基因kpc-2造成肺炎克雷伯杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药性的逆转。

肺炎克雷伯杆菌肺炎大鼠血清白介素-2、12和单核细胞趋化蛋白-1水平及干预研究

目的：观察幼龄sD大鼠肺炎克雷柏杆菌肺炎的临床表现、白介素（IL）和单核细胞趋化蛋F1-1（MCP-1）的水平及其干预后的变化。方法：将4～6周龄清洁级SD大鼠随机分为对照组、模型组和干预组，每组又分为3小组，每小组8只，其中模型组、干预组接种相同浓度、剂量的肺炎克雷伯杆菌菌液，对照组接种0．9％氯化钠注射液，接种成功24h左右，干预组给予头孢哌酮钠舒巴坦钠治疗。各小组抽样行x线检查，并分别于第3、5、7天取血清检测IL-2、IL-12和MCP-1。结果：模型组血清MCP-1水平在接种后各时间点均高于对照组和干预组（P〈0．05-P〈0．01），干预组接种后第3天血清MCP-1水平明显高于对照组（P〈0．01）。对照组各时间点MCP-1差异均无统计学意义（P〉0．05），模型组大鼠在接种后第5天和第7天血清MCP-1水平均显著高于第3天（P〈0．01），干预组在接种后第5天和第7天血清MCP-1水平均明显低于第3天（P〈0．01）。模型组血清IL-2和IL-12水平在接种后第5天和第7天均高于对照组和干预组（P〈0．01），模型组和干预组接种后第3天血清IL-2和IL-12水平均显著高于对照组（P〈0．01）。模型组接种后第5天和第7天血清IL-2和IL-12水平均明显高于第3天（P〈0．01），而干预组第5天和第7天IL-2和IL．12水平均显著低于第3天（P〈0．01）。结论：幼龄SD大鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎模型急性感染期IL-2、IL-12和MCP．1升高，说明这些细胞因子参与了肺炎克雷伯杆菌肺炎的病理生理过程，动态监测血清IL-2、IL-12和MCP-1水平可作为判断肺炎克雷伯杆菌肺炎病情轻重、转归的重指标。

头孢他啶联合氨溴索对2型糖尿病克雷伯杆菌肺炎患者免疫功能及炎症因子的影响

目的探讨头孢他啶联合氨溴索对2型糖尿病克雷伯杆菌肺炎患者免疫功能及炎症因子的影响。方法选择2017年2月—2018年6月本院收治的2型糖尿病克雷伯杆菌肺炎80例患者作为研究对象,随机数表法分为观察组和对照组两组,每组各40例。两组均行控制血糖的常规治疗,对照组在常规方案上增加氨溴索方案,观察组在对照组基础上加用头孢他啶治疗,比较两组免疫功能及炎症因子水平。结果治疗后,两组CD3^+、CD4^+均高于治疗前,CD8^+较治疗前低,且观察组改变程度较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05);两组血清降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)均低于治疗前,且观察组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗期间不良反应发生率对比,2组差异无统计学意义(P>0.05)。结论头孢他啶联合氨溴索用于2型糖尿病克雷伯杆菌肺炎患者中的效果较好,可改善其免疫功能,降低炎症因子水平,且不会明显增加不良反应发生率,安全性能较高。

幼龄SD大鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎模型的建立及炎症改变的研究

目的:探索建立幼年大鼠肺炎克雷伯杆菌肺炎模型的方法。观察模型的临床表现和C反应蛋白(CRP)、皮质醇、白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、血清单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平等。方法:48只4周龄SD大鼠随机分为对照组、模型组,以上各组按观察日龄再分成3小组。每小组8只,一定浓度的细菌菌液,对照组接种生理盐水。各小组于第3、5、7 d取血清测CRP、皮质醇、IL-2、IL-12、MCP-1等。结果:建立成功的模型组IL-2、IL-12、CRP、MCP-1、皮质醇升高;模型组IL-2、IL-12、CRP、MCP-1水平随着时间延长有升高趋势,皮质醇则下降,对照各小组间无差异。结论:本实验建立的肺炎模型更简便实用;肺炎模型CRP、皮质醇、IL-2、IL-12、MCP-1改变,能够作为判断大鼠肺炎病情改变的指标。

影响肺炎克雷伯菌粘附上皮细胞作用的研究

目的:研究不同理化及生物因素对肺炎克雷伯菌粘附宿主细胞的影响,探讨其粘附宿主细胞的可能机制。方法:用肺炎克雷伯菌临床分离株K.pnueumoniae 03183(K.p03183)建立粘附宿主细胞模型,通过结晶紫染色及扫描电镜观察其粘附效率;以不同理化及生物因素预处理K.p03183,平板菌落计数法观察上述因素对K.p03183粘附细胞的影响;用基因芯片技术,检测HMGN2蛋白预处理细菌对于其粘附相关基因表达的影响。结果:K.p03183可粘附至A549、T24、HeLa等3种上皮细胞系,其粘附率与E.coli 25992接近;氯化锂和盐酸胍、高碘酸钠及热预处理可明显降低K.p03183对于A549和T24的粘附率(P<0.05);同时,胃蛋白酶及HMGN2蛋白预处理K.p03183,也可抑制其对A549和T24的粘附(P<0.01);但胰蛋白酶预处理却能增加细菌对于A549细胞的粘附(P<0.05);同时,HMGN2还可通过上调dksA基因表达,从而干扰细菌粘附细胞。结论:肺炎克雷伯菌可能借助细胞壁及其表面蛋白和碳水化合物等成分粘附至宿主上皮细胞,通过非共价键结合表面蛋白或消除碳水化合物成分,抑制细菌粘附至宿主细胞。

2016-2018年东莞地区耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌的耐药表型、耐药机制和分子流行病学分析

目的通过研究东莞地区的耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)的耐药情况和基因分型,研究耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的亲缘性、耐药机制和bla_(KPC-2)基因环境,为临床寻找控制和治疗该致病菌的更优方案提供参考。方法回顾性收集2016年1月—2018年12月东莞市人民医院、东莞东华医院、康华医院、东莞市中医院和东莞市妇幼保健院等十三所医院的住院患者的CRE菌株进行常规微生物培养、鉴定和药敏试验。以美罗培南或亚胺培南纸片法(K-B法)或最小抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌目细菌进行初筛;采用改良Hodge试验、亚胺培南-EDTA双纸片协同试验和CIM试验检测CRE产酶情况;聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测并鉴定CRE的碳青霉烯类耐药基因(bla_(KPC)、bla_(NDM)、bla_(IMP)、bla_(DHA)、bla_(CTX-M)和bla_(CMY)),以及CRKP的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)和孔蛋白(OmpK35、OmpK36和OmpK37);通过Junction PCR、Mapping PCR和Crossing PCR检测bla_(KPC-2)基因环境;使用WHONET 5.6软件统计分析CRE临床分离株在标本和科室中的分布与耐药情况,以及碳青霉烯酶基因在科室中的分布情况。结果从37217株肠杆菌目细菌中共检出131株CRE(占0.35%),其中肺炎克雷伯菌79株(占60.31%)、大肠埃希菌21株(占16.03%)和阴沟肠杆菌12株(占9.16%);检出CRE的临床科室主要为ICU(66株,占50.38%);在检出CRE的标本中,位于前3位分别是痰液标本(56株,占42.75%)、尿液标本(21株,占16.03%)、伤口分泌物标本(12株,占9.16%);CRE对目前临床中常使用的抗菌药物表现出高耐药性,仅对阿米卡星耐药率较低,为21.38%。检测104株CRE(包括肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌)发现的碳青霉烯酶有KPC-2型(57,54.81%)、NDM-1型(7株,6.73%)和NDM-5型(2株,1.92%);其中,CRKP主要为ST11型(49株,占62.03%),其次为ST1型(25株,占31.65%);ompK35(75株,占94.94%)、ompK36(77株,占97.47%)和ompK37(79株,占100%)发生突变的占比高;bla_(KPC-2)的基因环境主要为B1型突变型(38株,占48.10%),其次为A型突变型(14株,占17.72%)。结论2016—2018年东莞地区临床CRE检出率为0.35%,耐药性强,其中,CRKP主要为ST11型,主要流行的是KPC-2型,其基因环境为B1型突变型,而且孔蛋白突变占比极高,这提示东莞地区bla_(KPC-2)基因主要通过质粒进行传播,并且孔蛋白突变在CRE中发挥重要作用,院内感染医务工作者应根据该菌科室分布、耐药情况和耐药机制等特点,采取合理有效的预防和治疗方法。

磷霉素、米诺环素等抗生素对bla_(KPC-2)肺炎克雷伯杆菌的体外药敏研究

目的研究筛选治疗产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯杆菌的敏感性抗生素。方法用氯霉素、多西环素、磷霉素、米诺环素和替加环素对已知blaKPC-2菌株进行体外药敏试验。结果氯霉素、多西环素米诺环素、磷霉素和替加环素耐药率分别为20%、17%、15%、6%和5%。结论本研究所选用抗生素的耐药率明显低于常规抗生素。

河南发现产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌

KPC酶是一种新的碳青霉烯酶，属于A类酶，水解所有的13内酰胺类抗生素，能被克拉维酸抑制。它不仅存在于肠杆菌科的细菌中心，也存在于铜绿假单胞菌等非发酵菌中。自2001年Yigit等在美国报道KPC-1之后，法国、希腊、中国等国家也发现了KPC酶。我国浙江地区曾报道了KPC酶。我们在临床分离到1株亚胺培南中敏的肺炎克雷伯菌，研究发现其产生KPC-2型碳青霉烯酶。

内源性抗生素肽HMGN2抗细菌内化作用及机制初探

目的探讨HMGN2抗细菌内化作用及其机制。方法利用生物学在线软件对人及常见医学模式生物HMGN2进行生物信息学分析;用免疫打点杂交技术检测临床标本HMGN2表达;设置以HMGN2预处理Klebsiella pneumoniae细菌后感染细胞组(简称共孵育组)和HMGN2预刺激细胞后再感染KP组(简称预刺激细胞组),平板菌落计数法检测两种状态下胞内活菌数;用荧光显微镜、流式细胞术观测各组细胞微丝形态和构成变化,用光镜观测HMGN2处理菌及未处理菌细胞骨架表型变化。结果不同属种生物HMGN2具有很高同源性,带阳离子电荷,具有α螺旋结构,分子量小于10kD;在炎性和非炎性标本中均可见HMGN2阳性信号,而在炎性标本中信号强度更大。HMGN2共孵育组和HMGN2预刺激细胞组胞内活细菌数与对照组相比较都明显减少,但共孵育组比预刺激细胞组胞内活菌数减少更为明显;荧光显微镜观察显示,两组微丝均有解聚成颗粒状向核周聚集现象,流式细胞术检测发两组细胞骨架微丝蛋白的平均荧光量减少,而油镜下HMGN2处理菌与未处理菌比较,其菌体长短径无明显的变化。结论 HMGN2属于内源性抗菌肽家族分子,可能通过促进细胞内微丝蛋白解聚成单体,减弱了KP内化入膀胱上皮细胞。

2-取代亚肼基-1,3-二硫杂环戊烷类化合物的合成及抗菌活性

目的为了寻找高效、低毒的农用杀菌剂,用超声波法合成新型的2-取代亚肼基-1,3-二硫杂环戊烷类化合物。方法以CS2、NH2NH2·H2O、BrCH2CH2Br为原料,在超声波辐射下合成中间体1,3-二硫杂环戊烷,然后再和取代芳香醛缩合得到3种未见文献报道的新化合物。结果总收率在60%以上。结构经IR,MS,1HNMR和元素分析所确证。结论该类化合物合成方法简单。初步的生物活性实验表明,这3种化合物对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、草绿色链球菌等有较好的抑杀作用。

生物催化不对称还原法制备(R)-和(S)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯

用全细胞催化法合成2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(EHPB)的两种对映异构体。筛选得到两株高立体选择性菌株,能催化前手性酮还原分别生产相应的手性醇。考察了这两株菌株的反应特性,得到了合适的反应条件:菌株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilusPhe-C3),反应24 h,底物浓度25 mmol/L,体系pH7.0,温度30℃,R-EHPB的产率达74.5%,对映体过量值(e.e.)达97%;菌株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumomiaePhe-E4),反应20 h,底物浓度15 mmol/L,体系pH7.0,温度30℃,S-EHPB的产率达71.7%,e.e.达95%。

产气肠杆菌中发现碳青霉烯酶KPC-2型

肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneunwniae Carbapenemase，KPC），属A类B-内酰胺酶。2010年3月25日我们从一家三等甲等医院老年患者的痰液中分离到1株碳青霉烯类耐药的产气肠杆菌（标本编号：20100323BAA049，经gyrA和parC基因扩增与测序，

产超广谱β内酰胺酶检测及药敏分析

目的分析产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药情况,指导临床合理用药。方法采用Walk Away 40SI细菌分析仪对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株进行鉴定及药敏试验检测,ESBLs表型确证试验采用双纸片法。结果大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs菌株检出率分别为42.9%和43.5%,均以下呼吸道和尿液标本来源为主。产ESBLs菌株具有多药耐药性,对头孢菌素类和青霉素类耐药率达80.0%以上,但对哌拉西林/他唑巴坦和亚胺培南耐药率均低于12.0%。结论亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦可作为治疗产ESBLs菌株感染的首选用药。

哌拉西林引起药物热1例

病例：患者，女，60岁，既往2型糖尿病、高血压病史。因反复低热40余天、伴咳嗽1月余并加重，于2011年8月18日来我院就诊。通过临床症状、体征、实验室检查、双肺CT等诊断为肺炎（右）、肺脓肿（右）、高血压（3级）、2型糖尿病、糖尿病肾病。痰培养示肺炎克雷伯杆菌，产超广谱β内酰胺酶（ESBLs），

2,3-丁二醇生产菌株生产能力的比较和培养基优化

对5株克雷伯氏肺炎杆菌(包括两株乳酸途径被敲除的工程菌株)发酵生产2,3-丁二醇能力进行了比较,其中K.pneumonia HR521 LDH(乳酸合成途径中ldhA基因被敲除)具有最佳的发酵性能。通过正交试验优化了其发酵培养基的主要组分,优化后的培养基组成为:葡萄糖90 g/L,(NH4)2HPO4 3 g/L,玉米浆(CLSP)6 g/L,乙酸钠5 g/L,KCl 0.4 g/L,MgSO4 0.1 g/L,FeSO4.7H2O 0.02 g/L,MnSO4 0.01 g/L。在优化后的发酵培养基中进行摇瓶发酵,24 h发酵乙偶姻和2,3-丁二醇的终浓度为37.46 g/L,比未优化前增加了10 g/L,2,3-丁二醇得率达到了理论得率的90.53%,生产强度1.56 g/(L.h),检测不到副产物乳酸的生成,利于后提取工艺的进行和工业生产的应用。

碳青霉烯耐药肠杆菌耐药机制及临床传播特征分析

目的研究临床分离碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌耐药机制并分析其临床传播特征。方法收集2015年10月至2016年9月临床分离非重复碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)43株,VITEK-2 compact全自动细菌分析仪鉴定到种,药物敏感试验采用最低抑菌浓度法及纸片扩散法,结果录入WHONET 5.6软件进行分析。改良Hodge试验与乙二胺四乙酸(EDTA)协同法检测碳青霉烯酶表型,聚合酶链反应法检测碳青霉烯耐药基因。应用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)对其中blaNDM-1阳性菌株进行分子流行病学分析。结果临床分离的43株CRE对临床常用抗菌药物耐药率较高,仅对阿米卡星较为敏感,其中改良Hodge试验阳性共25株,EDTA协同试验阳性共16株。PCR结果显示,24株CRE菌株检出blaKPC-2,15株CRE检出blaNDM-1,1株检出blaIMP-4,携带blaNDM-1肺炎克雷伯菌(13株,30.2%)检出率最高。PFGE结果显示,13株blaNDM-1阳性肺炎克雷伯菌分为6型(A^F)。其中A型为主要克隆株(7株),在多个临床科室间水平传播,且感染患者大多有ICU入住史。结论临床分离CRE菌株呈现多重耐药,其碳青霉烯耐药机制主要为产肺炎克雷伯碳青霉烯酶2型(Klebsiella pneumoniae carbapenemases,KPC-2)及新德里金属酶1型(New Delhi metallo-β-lactamase-1, NDM-1)型碳青霉酶烯酶。产NDM-1肺炎克雷伯菌检出率高且存在克隆传播。需加强检测及院感防控,防止耐药菌播撒。