甲基茉莉酸对喜树中HMGS基因表达的影响初探

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)基因是利用基因工程技术代谢调控喜树碱生物合成的重要靶点和关键酶基因之一,甲基茉莉酸(MJ)是植物次生代谢工程中比较常用的一种化学诱导子,对于活性次生代谢物质的合成及积累具有调控作用。本实验通过用10mg/L甲基茉莉酸喷洒喜树幼苗,来观察其对喜树中HMGS基因表达的调节效应。实验结果表明胚轴在处理12h后,HMGS基因表达量达到峰值,而子叶在被处理后,甲基茉莉酸对HMGS基因有抑制作用。

白木香3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(AsHMGS)基因的克隆与表达分析

以白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg)茎cDNA为模板,采用反转录PCR及RACE技术分离得到HMGS基因cDNA全长。序列分析表明该基因序列全长1 831 bp,共编码465个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.4 kD,理论等电点6.25,命名为AsHMGS。推导的AsHMGS蛋白质序列具有植物HMGS酶的典型结构,并预测出HMGS酶的活性中心。系统进化树分析表明,AsHMGS蛋白与拟南芥、琴叶拟南芥、芥菜的相应蛋白相似度最高,其次为人参、喜树和野茶树。荧光定量PCR结果显示,茉莉酸甲酯能诱导白木香AsHMGS的表达。

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS)是甲羟戊酸途径(MVA)中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。

桑黄HMGS基因克隆、分子特性及差异表达分析

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶羟甲基戊二酰辅酶A合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryCoAsynthase,HMGS)进行基因全长克隆、分子特性及差异表达分析研究。方法采用RACE技术克隆HMGS基因全长,并对其序列进行生物信息学分析;构建桑黄HMGS基因到表达载体pET-32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测;用荧光定量PCR的方法分析其不同发育阶段表达特性。结果HMGS基因cDNA全长为1930 bp,包含1个1458 bp的完整开放阅读框,编码485个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量约为52750,理论等电点是5.60,为亲水性蛋白,不具有跨膜结构,不含信号肽序列;系统发育分析表明,桑黄HMGS与地中海拟层孔菌Fomitiporia mediterranea中的HMGS同源性最高,属于一个分支。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小与预测的蛋白相对分子质量基本一致。HMGS基因的转录水平在桑黄不同发育阶段呈动态变化,该基因在菌丝体阶段的转录水平要高于原基及子实体阶段的转录水平。HMGS基因的最高转录水平出现在第14天,为对照第5天的2.33倍。结论HMGS基因的分子鉴定为进一步解析该基因在桑黄三萜类物质合成代谢途径中的分子调控作用奠定基础。

洋常春藤HMGS基因克隆与表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGS）是MVA途径中的关键酶基因,其作用主要是催化乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-Co A）。为分析洋常春藤HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的功能及调控机制,本研究利用RACE克隆技术克隆获得了洋常春藤HMGS基因c DNA全长序列并进行了生物信息学分析。结果表明：洋常春藤HMGS基因的c DNA全长1 751bp,命名为Hh HMGS（Gen Bank登录号：KX056075）,其包含编码468个氨基酸的开放阅读框。预测该基因编码的蛋白质分子量为52.0 k D,理论等电点为5.99。氨基酸序列比对结果表明,洋常春藤中的HMGS与人参的HMGS同源性最高,达到95%。通过RT-q PCR分析Hh HMGS基因在洋常春藤中的时空表达规律,结果表明Hh HMGS基因与常春藤皂苷含量之间并未呈现出相关性。本研究为探讨HMGS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用以及深入的研究该基因的分子调控机制奠定基础。

基于生物信息学分析HMG基因家族在肺腺癌中的表达和预后价值

目的探讨肺腺癌(LUAD)组织中高迁移率族蛋白(HMG)基因家族的表达,并分析其在LUAD患者中的预后价值。方法通过肿瘤基因图谱(TCGA)数据库获得HMG基因家族在LUAD中的表达数据及相关临床病理参数,并对HMG家族基因进行相关性分析。采用单因素Cox回归和LASSO Cox回归分析HMG基因家族与总生存期(OS)的关系,并构建HMG基因家族预后风险模型。根据风险评分中值将患者分为高风险组和低风险组,采用Kaplan-Meier进行生存分析。最后利用临床病理参数和风险评分构建预后列线图。结果HMGA1、HMGA2、HMGB2、HMGB3、HMGB4、HMGN1在LUAD中的表达量高于正常样本,HMGB1和HMGN5在LUAD中的表达量低于正常样本(均P<0.05),大多数HMG基因之间呈正相关,但HMGN3的表达与HMGA1、HMGA2呈负相关。4个HMG基因与OS相关(P<0.05),其中HMGA1、HMGA2、HMGB2是危险基因,HR>1;而HMGN3为保护基因,HR<1。Kaplan-Meier生存分析显示高风险组OS比低风险组OS更差(P<0.05)。低风险组和高风险组N、T和分期差异均有统计学意义(均P<0.05)。多因素Cox回归分析表明风险评分和分期是LUAD患者OS的独立影响因素(均P<0.05)。列线图可以系统预测LUAD患者1、3和5年的OS。结论HMG基因家族在LUAD发生和发展中起到重要作用,有望为LUAD预后标志物的筛选和预后评价提供参考。

甘蓝型油菜HMG基因家族的生物信息学分析

为研究甘蓝型油菜HMG(high mobility group)基因家族的起源、进化和功能,利用生物信息学方法对甘蓝型油菜和其近缘物种HMG基因家族进行鉴定,并对其进化、基因结构、组织表达、直系旁系同源基因进行系统分析。在甘蓝型油菜中鉴定到45个HMG家族成员,并根据进化树和基因结构将其分成5组。染色体定位发现,19条染色体中有18条染色体有HMG基因,说明该家族基因分布较广泛。在甘蓝型油菜与甘蓝、白菜和拟南芥分别鉴定到45、47和26个直系同源基因对。在甘蓝型油菜中鉴定到28个旁系同源基因对,而在其它3个物种中则比较少,这可能与甘蓝型油菜的多次基因组加倍有关。对45个甘蓝型油菜BnHMG基因在根和叶中的表达模式进行分析,结果显示,大多数基因在根和叶中均有表达,且呈现出不同的表达模式。

转基因抗草丁膦油菜籽中Barnase基因的实时荧光定量PCR检测

利用荧光定量PCR技术,对进口抗草丁膦油菜籽中的Barnase基因进行了定量检测,分别建立了抗草丁膦油菜籽参照样品外源Barnase基因和内标准HMG基因C t值与模板量之间的标准曲线和线性回归方程,运用所建立起来的方法对14批油菜籽样品进行了定量分析。

性别决定基因相关HMG盒基因4、β-连环蛋白在结直肠癌组织中的表达及意义

目的观察结直肠癌组织中性别决定基因相关HMG盒基因4（Sox4）、β-连环蛋白（β-catenin）的表达，探讨Sox4、β-catenin在结直肠癌组织中表达的意义及其相关性。方法采用免疫组织化学染色方法检测80例结直肠癌组织及20例其邻近正常结直肠组织中Sox4、B—catenin的表达，分析其在结直肠癌组织中的表达与临床病理参数问的关系。结果Sox4在正常结直肠组织黏膜中未见Sox4表达，在结直肠癌组织中高表达，阳性表达率为68．75％（55／80），Sox4在结直肠癌组织中的表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、浸润深度、分化程度无明显相关（P〉0．05），Sox4在伴有淋巴结转移、Ⅲ--Ⅳ期的结直肠癌组织中的表达率分别明显高于无淋巴结转移、I～Ⅱ期的表达率（51．2％，P〈0．05）。β-catenin在正常结直肠组织黏膜中主要表达于细胞膜，在结直肠癌组织中异位表达，异位表达阳性率为63．75％（51／80）；B．catenin在结直肠癌组织中异位表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、浸润深度无明显相关（P〉0．05）。β-catenin在伴有淋巴结转移、中高分化、Ⅲ一Ⅳ期的结直肠癌组织中的表达率分别明显高于无淋巴结转移、低分化、I一Ⅱ期（P〈0．05）。结直肠癌组织中Sox4表达与β-catenin表达两者呈明显正相关（r=0．501，P〈0．01）。结论Sox4和β-catenin在结直肠癌组织中异常表达，参与结直肠癌的发生、发展，两者之间密切相关。

性别决定基因相关HMG盒基因4和细胞核增殖抗原在胃癌组织的表达及临床意义

目的观察胃癌组织中性别决定基因相关HMG盒基因4（SOX4）和细胞核增殖抗原（Ki-67）的表达，探讨SOX4和Ki-67在胃癌组织表达的临床意义。方法采用免疫组织化学方法检测60例胃癌组织及60例其邻近正常胃组织中SOX4和Ki-67的表达，分析其在胃癌组织中的表达与临床病理特征间的关系。结果SOX4在胃癌组织中呈高表达，阳性表达率为71.7%（43/60），在正常胃组织中未见SOX4表达，Ki-67在胃癌组织中呈高表达，阳性表达率为86.7%（52/60），两者呈明显正相关（r＝0.615, P＝0.003）；SOX4和Ki-67在胃癌组织中的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度无明显相关（χ^2＝0.056，P＝0.821；χ^2＝0.572，P＝0.461；χ^2＝0.131，P＝0.882；χ^2＝1.479，P＝0.223；χ^2＝0.652，P＝0.482；χ^2＝0.567，P＝0.512；χ^2＝0.545，P＝0.652；χ^2＝0.781，P＝0.691），SOX4和Ki-67表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期明显相关（χ^2＝6.522，P＝0.016；χ^2＝7.681，P＝0.005；χ^2＝9.205，P＝0.003；χ^2＝6.761，P＝0.012；χ^2＝5.521，P＝0.032；χ^2＝5.857，P＝0.017），SOX4和Ki-67在低分化、淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期胃癌组织中的表达水平明显增高。结论SOX4和Ki-67在胃癌组织中呈高表达，参与胃癌的发生、发展，两者之间密切相关。

人HMG盒转录因子1基因shRNA质粒的构建及其功能鉴定

目的构建人HMG盒转录因子1(HMG-box transcription factor 1,HBP1)基因shRNA质粒,并探讨该基因的相关功能。方法合成HBP1基因干扰序列,将其插入至慢病毒表达载体pLL3. 7中,构建重组质粒pLL3. 7-shHBP1,经TurboFectTM脂质体介导转染HEK293T细胞,收集含病毒的培养基,分别感染HeLa及HepG2细胞,经puromycin持续筛选,获得稳定转染细胞株。Real-time PCR及Western blot法分别检测HeLa及HepG2细胞中HBP1基因m RNA转录及蛋白表达水平,MTT及流式细胞术分别检测HBP1基因抑制对HeLa细胞增殖及凋亡的影响。结果经测序鉴定,重组质粒pLL3. 7-shHBP1构建正确。HeLa及HepG2细胞中HBP1基因mRNA转录及蛋白表达水平均明显下调(P <0. 01);HBP1基因抑制后,HeLa细胞的增殖速度明显加快(P <0. 01),细胞凋亡明显减少(P <0. 01)。结论成功构建了HBP1基因shRNA质粒,抑制HBP1表达后可使HeLa细胞的增殖速度加快,细胞凋亡减少。本实验为HBP1基因相关功能的进一步研究奠定了基础。

沉默性别决定基因相关HMG盒基因-6对调控胶质瘤细胞增殖的研究

目的 观察小分子干扰RNA（siRNA）沉默性别决定基因相关HMG盒基因-6（SOX-6）对体外胶质瘤细胞增殖能力的影响.方法 人胶质瘤母细胞细胞瘤LN229细胞株体外培养后,分为3组,实验组、对照组分别以SOX-6 siRNA、Control siRNA-A转染后培养,空白组常规培养,采用免疫组织化学染色和免疫荧光法鉴定SOX-6 siRNA转染成功率,采用细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞增殖改变.结果 实验组和对照组SiRNA转染率＞80％;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）结果显示,与对照组及空白组比较,实验组SOX-6表达显著降低（0.427±0.032比0.612±0.055比0.609±0.049）,CCK-8实验检测结果显示,与对照组和空白组比较,实验组吸光度（A450）值在24、48、72 h均明显降低（P＜0.01）.结论 采用siRNA沉默SOX-6基因可调控胶质瘤细胞的体外增殖.