热量限制通过HNF3γ下调NOX4表达来抑制内皮细胞的衰老

为了观察热量限制对主动脉内皮细胞中HNF3γ及NOX4基因表达的影响,揭示HNF3γ-NOX4-活性氧通路介导热量限制抗内皮细胞衰老的分子机制,文章将主动脉内皮细胞分为5组:对照组、高热量组、低热量组、siRNA+低热量组、siRNA+高热量组。应用逆转录实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)、Westernblotting分析各组HNF3γ、NOX4 mRNA及蛋白水平变化,并检测各组细胞内活性氧产量及细胞衰老程度变化。采用染色质免疫共沉淀分析HNF3γ蛋白与NOX4基因启动子区域结合情况,萤光素酶报告基因检测HNF3γ蛋白结合后对NOX4基因启动子活性的影响。结果显示:与对照组比较,低热量组HNF3γmRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著升高(P<0.05),NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著降低(P<0.05);高热量组HNF3γmRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著降低(P<0.05),NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著升高(P<0.05);siRNA+低热量组及siRNA+高热量组中NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧水平及细胞衰老程度显著升高(P<0.05)。染色质免疫共沉淀证实HNF3γ蛋白可与NOX4基因启动区域4个结合位点(6 bp、76 bp、249 bp、954 bp)结合。萤光素酶报告基因检测显示HNF3γ蛋白与NOX4启动子区域1个位点(6 bp)、2个位点(6、76 bp)、3个位点(6、76、249 bp)、4个位点(6、76、249、954 bp)结合,可使NOX4启动子活性分别降低至对照组的80.15±4.64%、40.02.±2.15%、16.46±2.24%、12.13±1.46%,P<0.05。上述结果提示热量限制可上调HNF3γ基因表达,增强HNF3γ蛋白活性,促进HNF3γ蛋白同NOX4基因启动子区域结合,抑制NOX4基因表达,进而减少细胞内活性氧产生而延缓动脉内皮细胞衰老。

牛磺酸对STZ诱导的糖尿病大鼠胰高血糖素转录调控因子HNF3α蛋白表达的作用

本试验通过利用STZ诱导糖尿病大鼠模型来测定牛磺酸对大鼠糖代谢、血清胰岛素水平、血清胰高血糖素水平的影响以及HNF3α在胰高血糖素分泌中的作用,试验结果表明:在利用ELISA法检测血清中Ins水平时,糖尿病模型组大鼠血清Ins的水平显著低于空白对照组.经牛磺酸治疗后,可使糖尿病大鼠血清Ins水平显著升高;牛磺酸低、高剂量组可将糖尿病大鼠血清Ins降至接近正常水平.糖尿病模型组大鼠血清Glc水平显著高于空白对照组.牛磺酸治疗可显著降低糖尿病大鼠血清Glc水平,与正常大鼠Glc水平差异不显著.推测牛磺酸降低糖尿病大鼠血糖的另一途径可能是通过调节胰高血糖素的合成和分泌来实现的.试验中给正常大鼠饲喂牛磺酸对血清Glc水平无影响,表明牛磺酸对于正常条件下胰高血糖素的合成和分泌作用不显著.另外,糖尿病模型组大鼠胰腺组织中HNF3α蛋白表达量显著高于正常大鼠;经牛磺酸治疗后,可显著降低糖尿病大鼠胰腺HNF3α蛋白表达至接近正常水平.推测牛磺酸可以通过抑制HNF3α的表达,进而抑制胰高血糖素原基因的转录.

在Huh7细胞中原儿茶酸对肝细胞核因子(3α/3β/4α)的影响

研究在Huh7细胞中原儿茶酸对肝细胞核因子(3α/3β/4α)的影响,通过荧光定量PCR和蛋白印迹的方法检测,结果显示原儿茶酸不仅能抑制Huh7细胞中肝细胞核因子(3α/3β/4α)的m RNA水平,还能抑制肝细胞核因子4α的蛋白水平,综上所述原儿茶酸能够抑制Huh7细胞中肝细胞核因子(3α/3β/4α)的表达.

金丝桃素在细胞水平对抗乙肝病毒新靶点pgRNA的作用研究

乙型病毒性肝炎是由乙型嗜肝DNA病毒（ hepatitis B vi-rus， HBV）引起的一种世界范围内的传染性疾病，对人类健康危害重大［1］。目前，临床上应用最广泛的抗乙肝病毒药物是拉米夫定（lamivudine，3TC）等核苷类化合物［2］，但长期应用核苷类药物，编码HBV DNA聚合酶／逆转录酶的基因区域会发生点突变而产生病毒耐药株，使得抗病毒效果大为下降［3］。因此，寻找新的抗病毒药物靶点成为乙肝研究中的重点与热点。金丝桃素（ hypericin，4，4′，5，5′，7，7′-六羟基-2，2′-二甲基［中位］萘骈二蒽酮），是贯叶连翘等金丝桃素植物的主要活性成分之一，有强效抗乙肝病毒活性，但与核苷类药物不同，其对HBV DNA聚合酶／逆转录酶无抑制作用，却可以明显下调pgRNA表达水平，提示其药物作用靶点可能与pgRNA相关［4］。本实验对金丝桃素抗乙肝病毒作用进行验证，并在此基础上对金丝桃素的可能靶点pgRNA以及靶点相关调控因子的表达进行了更加深入的研究。

斑马鱼shh启动子指导绿色荧光蛋白基因在脊索中的表达

体外实验业已证明shh基因的启动子受HNF3β蛋白直接调控。为研究斑马鱼shh启动子在体内的作用模式 ,构建了由 5 38bp斑马鱼shh启动子 (包含两个HNF3β结合位点 )与绿色荧光蛋白EGFP组成的表达载体 ,命名为pShh EGFP。将pShh EGFP注射到斑马鱼 1 细胞期内的受精卵中 ,定期在倒置荧光显微镜下观察GFP的表达。GFP在原肠作用期就开始表达 ,主要发生在中轴下胚层中 ;在体节形成期 ,GFP在脊索细胞中表达 ,但未发现在神经底板细胞中表达。由此可见 ,含两个HNF3β结合区域的 5