德州驴HO-1基因生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】克隆德州驴血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因,对其进行原核表达及多克隆抗体制备,同时检测HO-1基因在德州驴不同组织中的表达情况,为后期研究HO-1基因功能提供支撑材料。【方法】参考GenBank中公布的马HO-1基因序列(登录号:XM_023631135.1)设计特异性引物,从驴原代肺泡巨噬细胞(donkey primary alveolar macrophages,DPAMs)中提取RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增HO-1基因编码区(coding sequences,CDS),对测序所获序列与其他物种进行相似性比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对HO-1基因编码蛋白进行生物信息学分析。将HO-1基因序列克隆至pCold-SUMO载体进行原核表达,经镍柱亲和层析纯化后,以重组的HO-1蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,利用ELISA和Western blotting检测多克隆抗体特异性及与抗原结合的最大稀释度。利用免疫组化试验检测德州驴4种组织中HO-1蛋白的表达水平。【结果】德州驴HO-1基因CDS区全长873 bp,编码290个氨基酸,其氨基酸序列与马的相似性最高,亲缘关系最近,与鸡的相似性最低,亲缘关系最远。德州驴HO-1蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白,分子质量为33.04 ku,无信号肽,存在1个跨膜区,二级结构以α-螺旋为主。ELISA、Western blotting结果显示,针对HO-1制备的多克隆抗体与HO-1结合最大的稀释度为1∶102400,宿主HO-1蛋白可被制备的多克隆抗体识别。免疫组化结果显示,德州驴4种组织中均有效表达HO-1蛋白。【结论】本研究成功获得德州驴HO-1重组蛋白,并制备特异性多克隆抗体,为后续深入探究HO-1基因在马属动物感染病原过程中的作用提供参考依据。

HO-1基因启动子微卫星多态性与COPD易感性的研究

目的:探讨HO-1启动子微卫星多态性与COPD易感性的关系。方法:应用PCR技术结合聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色,根据年龄组及吸烟史对57例COPD患者和44例非COPD人群血红素加氧酶-1(HO-1)启动子微卫星多态性进行分析。结果:COPD组HO-1基因启动子(GT)n大量重复序列(n】30)(L型等位基因)的频率(0.2105)显著高于对照组(0.0909)(P【0.05)而(GT)n小量重复序列(n【25)(S型等位基因)的频率(0.3158)显著低于对照组(0.4545)(P【0.05)。不同年龄组以及在吸烟指数【31PY时,两组人群HO-1启动子微卫星多态性分布未发现显著性差异(P】0.05),但当吸烟指数≥31PY时,COPD组L型等位基因频率显著高于对照组(P【0.05)。结论:①HO-1启动子(GT)n大量重复序列可能与大量吸烟人群的COPD易感性有关,可能在一定程度上参与了COPD的发病机制。②HO-1基因启动子微卫星多态性可作为一种遗传标记用于早期发现对COPD易感的高风险吸烟人群,对于预防COPD的发展具有重要意义。

70周龄长顺绿壳蛋鸡HO-1基因在不同组织中表达差异研究

为研究HO-1基因在70周龄长顺绿壳蛋鸡不同组织中的表达差异,选取70周龄长顺绿壳蛋鸡9只(每种基因型3只),采集每只鸡的大脑、肝脏、肾脏、卵巢、输卵管和子宫组织,提取其总RNA进行反转录,利用实时荧光定量PCR方法检测样品中HO-1基因的表达水平,比较同一组织不同基因型及同一基因型不同组织间HO1基因mRNA的表达差异。结果表明,在同一组织不同基因型及同一基因型不同组织间HO-1基因的表达存在差异;其中HO-1基因在肝脏中表达量最高,且3种基因型间肝脏表达量存在极显著差异(P<0.01);白壳蛋鸡子宫中HO-1基因表达量极显著高于其他两种(P<0.01),纯合绿壳蛋鸡与杂合绿壳蛋鸡无显著差异(P>0.05)。

大鼠HO-1基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)的慢病毒表达载体。方法构建HO-1基因表达质粒GV208-EGFP-HO-1,并进行测序鉴定。重组质粒GV208-EGFP-HO-1与两种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后测定病毒滴度。结果成功构建HO-1基因表达质粒GV208-EGFP-HO-1,转化感受态DH5ɑ大肠杆菌。挑阳性单克隆PCR得到1074 bp的特异性条带,测序结果与目标序列完全一致。将HO-1基因过表达载体质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞后在荧光显微镜下发出明显绿色荧光。Western Blot检测观察到58 kD附近处有特征条带,其大小和目的基因融合蛋白相吻合。病毒原液滴度为2×1012TU/L。结论成功构建HO-1的慢病毒表达载体,为研究HO-1基因对缺血性心脏病的影响打下基础。

血红素氧合酶1基因-413A/T位点多态性与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征相关性研究

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）是一种常见疾病,具有一定的家族遗传性.OSAHS常与高血压、肥胖、高血脂等并存^[1].基因多态性与OSAHS的研究近年来得到学者们的重视^[2].有研究指出,血红素氧合酶1 （heme oxygenase1,HO-1）基因参与抗氧化和应激^[3],HO-1基因的表达产物与动脉粥样硬化关系密切.还有研究报道,HO-1在体内表达的水平和冠心病的发病状况紧密关联^[4].而众所周知,OSAHS的发病又与冠心病密切相关联^[5].

HO-1 siRNA表达载体的构建及其稳定转染SGC7901细胞系的建立

目的:构建携带绿色荧光蛋白的HO-1基因siRNA表达载体,通过将载体转染入胃癌细胞株SGC7901筛选稳定转染细胞株。方法:参照前期工作,构建可用于筛选阳性克隆并带有绿色荧光的HO-1基因siRNA表达载体,采用脂质体转染法将载体转入SGC7901细胞中,并用G418进行阳性克隆筛选,获得稳定转染细胞系。结果:经酶切和测序验证,证实表达载体构建成功,将HO-1 siRNA表达载体转入SGC7901后,通过G418筛选获得稳定转染细胞系,经检测HO-1的表达水平明显低于为未转染的细胞。结论:本实验成功地构建了HO-1基因siRNA表达载体,筛选出HO-1基因沉默的稳定转染胃癌细胞系,为今后研究HO-1基因的作用机制提供了实验基础。

血红素加氧酶-1基因多态性对新生儿高胆红素血症的影响

目的血红素加氧酶(heme oxygenase,HO),其HO-1是分解亚铁血红素的重要限速酶,HO-1基因5’端(GT)n二核苷酸长度多态性对HO-1基因转录具有调控作用,对胆红素生成有重要作用,也是导致新生儿高胆红素血症的重要因素。但在不同人群中,HO-1启动子基因型多态性对高胆红素血症的影响,结果却不尽相同。

合成血红素加氧酶-1-shRNA载体的实验研究

根据Genebank提供的大鼠HO-1(Hmoxl,血红素加氧酶-1)基因序列,参照RNA干扰序列设计原则,设计针对HO-1的4个RNA干扰序列,定向克隆至表达载体pGPU6-GFP-Neo中,最后采用BamH I和Pst I酶切凝胶电泳鉴定。鉴定结果显示成功合成了荷载HO-1-shRNA的表达载体。

鸡蛋绿壳性状与候选基因研究进展

绿壳蛋是蛋鸡壳色的一个重要表型，也是最直观的品种特征。绿壳蛋颜色是由一个主效基因和多个微效基因控制的综合性状。目前国内外针对鸡绿壳蛋品质与遗传开展了大量的研究工作。本文简要介绍鸡绿壳蛋形成机理、蛋品质分析与绿壳分子遗传研究进展，以期促进鸡蛋绿壳性状的研究与应用。

siRNA抑制牛子宫内膜上皮细胞Nrf2基因的表达研究

为探讨核因子E2相关因子(nuclear factor E2 related factor,Nrf2)基因沉默及激活后对牛子宫内膜上皮细胞的影响,本试验利用小分子干扰(siRNA)技术及Nrf2的激动剂叔丁基对苯二酚(tBHQ),分别从Nrf2基因的下调和上调表达来研究Nrf2对牛子宫内膜上皮细胞中血红素加氧酶-1(HO-1)和Homebox A10(HOXA10)基因表达的影响。结果显示,经实时荧光定量PCR方法检测,在设计的2条siRNA序列(siRNA-1209和siRNA-1672)中,siRNA-1672在终浓度为75 nmol/L、作用时间24 h时抑制效果较好,抑制效率在80%以上;经Western blotting方法检测,Nrf2蛋白表达水平在转染后96 h极显著下降(P<0.01),而HO-1和HOXA10的mRNA表达量分别下降了60%和70%(P<0.01),蛋白表达量在96 h后极显著或显著下降(P<0.01;P<0.05)。此外,经CCK8方法检测,Nrf2基因表达沉默后,牛子宫内膜上皮细胞增殖能力减弱。而在tBHQ激活Nrf2试验中,经Western blotting方法检测,tBHQ终浓度为30μmol/L时Nrf2蛋白表达量最高,极显著高于对照组(P<0.01),且HO-1和HOXA10的蛋白表达量与对照组相比也明显上升。结果表明,本试验设计的siRNA-1672能特异性地抑制牛子宫内膜上皮细胞Nrf2的表达,而抑制Nrf2的表达会导致牛子宫内膜上皮细胞增殖能力下降,且Nrf2对牛子宫内膜上皮细胞HO-1和HOXA10基因表达存在调控作用。