枸杞多糖通过激活Nrf2/HO-1通路保护HK-2细胞氧化损伤的作用

目的分析枸杞多糖(LBP)干预对氧化损伤的人肾小管上皮细胞(HK-2)内的核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)通路蛋白表达的变化,探索LBP拮抗HK-2细胞氧化损伤的分子机制。方法采用过氧化氢诱导HK-2细胞制备氧化损伤细胞模型,HK-2被分成4组:正常组、LBP组、氧化损伤组及LBP干预组。观察4组细胞的长势和形态变化;细胞活力测定法比较每组细胞的存活率;比色法分析氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)的水平;免疫印迹技术检测细胞内Nrf2/HO-1通路蛋白Nrf2、HO-1的相对水平。结果正常组和LBP组相比,两组的细胞长势、形态和存活率,细胞产生MDA的量、SOD和GSH-Px的水平,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对水平均无明显差异(均P>0.05);氧化损伤组和正常组相比,细胞皱缩变圆并脱落、贴壁细胞变少,存活率减少、MDA量增加、SOD和GSH-Px降低,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对值下降(均P<0.05);LBP干预组和氧化损伤组相比,细胞长势、形状恢复、贴壁细胞较多,存活率增加、MDA量减少、SOD和GSH-Px升高,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对值升高(均P<0.05)。结论枸杞多糖能通过激活Nrf2/HO-1通路提高HK-2细胞的抗氧化酶活性达到减轻细胞氧化损伤的目的。

基于Nrf2/HO-1通路探讨藏红花素对后循环缺血性眩晕大鼠的影响及机制

目的研究藏红花素对后循环缺血性眩晕(Posterior circulation ischemic vertigo,PCIV)大鼠的影响,并基于核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)通路探索其作用机制。方法将60只清洁级雄性SD大鼠按随机数字表法分为5组:假手术组、模型组、藏红花素(60 mg/kg)组、ML385(Nrf2抑制剂,30 mg/kg)组和藏红花素(60 mg/kg)+ML385(30 mg/kg)组。除假手术组外,其余4组通过结扎右侧颈总动脉和右侧锁骨下动脉构建PCIV动物模型。各组分别1次/d连续治疗1周后,通过电刺激逃避实验考察大鼠眩晕症状程度,检测前庭神经核血流量、血液流变学指标[全血黏度(低切、中切、高切)、血浆黏度]和红细胞参数[聚集指数(Erythrocyte aggregation index,EAI)、红细胞刚性指数(Index of rigidity of erythrocyte,IR)、红细胞压积(Hematocrit,HCT)、血沉(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)],HE染色观察脑组织病理变化,检测脑组织乳酸(Lactic acid,Lac)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性,Western blot法检测脑组织核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)、胞浆NF-κB p65、胞核NF-κB p65蛋白表达水平。结果与模型组比较,藏红花素组电刺激逃避潜伏期缩短,前庭神经核血流量升高,全血黏度、血浆黏度、EAI、IR、HCT、ESR降低;脑组织结构疏松,神经元数量减少,空泡变性、胞核偏移、核膜边界不清等病理变化明显改善;脑组织Lac、LDH、IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA含量降低,SOD、CAT活性升高,Nrf2、HO-1表达量升高,胞核NF-κB p65表达量和胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65比值降低,差异有统计学意义(P<0.05)。ML385作用与藏红花素相反,ML385组眩晕症状及其他检测指标变化较模型组更加严重。ML385可明显逆转藏红花素对PCIV大鼠眩晕症状、前庭神经核血流量的改善作用及Nrf2、HO-1、胞核NF-κB p65蛋白表达等其他指标的调控作用。结论藏红花素可改善PCIV大鼠眩晕症状和前庭神经核血流量,抑制炎症反应和氧化应激损伤,减轻脑组织损伤,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB核转位有关。

基于Nrf2/HO-1通路探讨大承气汤治疗小鼠重症急性胰腺炎并发急性肾损伤作用机制

目的探讨大承气汤治疗小鼠重症急性胰腺炎(SAP)并发急性肾损伤(AKI)的可能作用机制。方法采用胆胰管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠制备SAP小鼠模型。将30只C57BL/6小鼠分为假手术组、模型组和大承气汤组,大承气汤组术后5、13、21 h予大承气汤灌胃,假手术组和模型组予生理盐水灌胃。术后24h观察小鼠一般状况,检测血清淀粉酶(AMY)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量;观察小鼠胰腺及肾组织形态,检测肾组织核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)mRNA及蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组小鼠精神萎靡,反应差,血清AMY、TNF-α、IL-1β、IL-6、SCr、BUN、MDA含量明显升高(P<0.001),SOD含量明显降低(P<0.001);胰腺组织和肾组织出现细胞水肿、坏死及炎性细胞浸润等变化,病理评分明显升高(P<0.001),肾组织Nrf2 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01,P<0.05),HO-1蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,大承气汤组小鼠整体状态尚可,血清AMY、TNF-α、IL-1β、IL-6、SCr、BUN、MDA含量明显降低(P<0.001,P<0.01),SOD含量明显升高(P<0.05);胰腺组织和肾组织损伤均减轻,病理评分明显降低(P<0.05,P<0.001),肾组织Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论大承气汤能减轻SAP小鼠全身炎症反应,改善小鼠胰腺和肾组织病理损伤,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路、调节氧化应激反应相关。

基于Nrf2/HO-1通路探讨捏脊改善孤独症大鼠行为障碍的机制研究

目的从氧化应激及核因子NF-E2相关因子-2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)通路探讨捏脊改善孤独症大鼠行为障碍的作用机制。方法将孤独症模型大鼠随机分为模型组、捏脊组,每组9只;同时纳入9只正常大鼠为空白组。捏脊组进行捏脊,21次/d,持续28 d。干预结束,各组大鼠进行行为学检测后处死取材,灌注固定后Nissl染色检测海马CA1、CA2区神经元损伤情况,取海马以生化试剂盒检测还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)表达,Western blot检测Nrf2及其磷酸化指标p-Nrf2、HO-1、NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]表达。结果与空白组比较,模型组社交指数、站立次数均显著降低(P<0.01),理毛次数显著增多(P<0.01);与模型组比较,捏脊组社交指数、站立次数均明显提升(P<0.01),理毛次数减少(P<0.05)。空白组神经元细胞排列紧密,形态规则,尼氏体数量丰富;模型组有大量神经元受损,细胞核固缩深染,细胞膜破裂、边界模糊,尼氏体偏移、溶解,尼氏体阳性细胞数量减少;捏脊组细胞排列基本整齐,核固缩形态有所改善,细胞形态可,尼氏体阳性细胞数量增加。与空白组比较,模型组GSH、SOD、CAT、p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1表达量均降低(P<0.05或P<0.01),MDA表达量明显升高(P<0.01);与模型组比较,捏脊组GSH、SOD、CAT、p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1表达量均升高(P<0.05或P<0.01),MDA表达量显著下降(P<0.01)。结论捏脊能改善孤独症大鼠行为障碍,与其活化Nrf2/HO-1通路、引起抗氧化因子表达、改善氧化应激、减轻神经元损伤有关。

电针激活Nrf2/HO-1通路抗帕金森病模型小鼠氧化应激的机制研究

目的观察电针“风府”“太冲”“足三里”穴对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型小鼠大脑纹状体中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)、核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)水平的影响,探讨电针治疗PD的可能机制。方法将30只小鼠按随机数字表法分为对照组、模型组和电针组,每组10只。模型组、电针组小鼠按照30 mg/kg腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)制备PD小鼠模型。电针组小鼠给予“风府”“太冲”“足三里”穴电针干预,每日1次,每次30 min,连续干预12 d。其余两组小鼠不予任何干预。采用爬杆实验和悬挂实验观察3组小鼠行为学改变,旷场实验观察小鼠自主运动总路程,免疫组织化学法检测小鼠大脑纹状体中TH表达水平,实时荧光定量PCR法检测小鼠大脑纹状体中Nrf2、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法检测小鼠大脑纹状体中TH、Nrf2、HO-1蛋白表达水平。结果与模型组比较,电针组小鼠爬杆时间和悬挂时间显著缩短(P<0.05),自主运动总路程显著增加(P<0.05);小鼠大脑纹状体中TH阳性神经纤维较稠密;TH阳性纤维表达水平,Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px mRNA表达水平,TH、Nrf2、HO-1蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。结论电针小鼠“风府”“太冲”“足三里”穴能上调大脑纹状体中Nrf2、HO-1表达水平,减轻PD小鼠氧化应激,从而提高纹状体中TH阳性纤维表达,这可能是电针治疗MPTP诱导的PD小鼠行为学障碍的作用机制。

益肾健脾化瘀汤通过调节Keap1/Nrf2/HO-1通路减轻STZ致大鼠肾损伤

目的:基于Keap1/Nrf2/HO-1通路观察益肾健脾化瘀汤(YJHD)减轻链脲佐菌素(STZ)所致大鼠肾损伤的情况。方法:在60只SD雄性大鼠中随机选取10只作为对照组,普通维持饲料喂养,其余50只大鼠给予高脂饲料喂养,4 w后,单次小剂量腹腔注射STZ,将造模成功的40只大鼠按照每组10只随机分为模型组、YJHD低、高剂量组和阳性药物组[卡格列净(CANA)组],阳性药物选择卡格列净(CANA),灌胃8 w,同时间内模型组灌胃等容积的蒸馏水。给药后测定口服糖耐量(OGTT)以及曲线下面积(AUC),收集尿液测定24 h尿蛋白,取材时取血,用血清样本测定血肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及丙二醛(MDA)的水平,HE染色观察肾组织病理改变情况,Western blot迹检测肾组织中Keap1、Nrf2、HO-1水平。结果:与对照组相比,模型组FBG、AUC明显升高(P<0.05),24 h尿蛋白、Cre、BUN水平明显升高(P<0.05),MDA明显升高,SOD、GSH-Px以及CAT明显下降(P<0.05),肾组织中可见大量的炎性细胞增生浸润,Keap1的表达明显升高,Nrf2和HO-1的表达明显降低(P<0.05)。与阳性药物组相比,YJHD组FBG、AUC水平明显下降(P<0.05),24 h尿蛋白、Cre、BUN水平都有明显改善(P<0.05),MDA水平降低,SOD、GSH-Px、CAT水平提高(P<0.05),而在肾组织中,细胞的增生浸润情况有所缓解,Keap1的蛋白表达量降低,Nrf2和HO-1蛋白表达量明显升高(P<0.05)。结论:益肾健脾化瘀汤可能是通过Keap1/Nrf2/HO-1通路来缓解减轻STZ所致的大鼠的肾损伤。

基于Nrf2/HO-1通路探讨健骨颗粒含药血清对氧化应激状态成骨细胞骨形成的调控机制

目的 基于Nrf2/HO-1通路探讨健骨颗粒含药血清对氧化应激状态成骨细胞骨形成的调控机制。方法 取6周龄SPF级雄性SD大鼠40只,随机分为健骨颗粒组和生理盐水组各20只。健骨颗粒组每天灌服含生药量7.8 g/kg健骨颗粒浸膏稀释液2 mL,生理盐水组每天灌服生理盐水2 mL,2组每日灌胃1次,灌胃7 d后取大鼠腹主动脉血制备健骨颗粒含药血清和生理盐水血清。将课题组前期选用UMR-106细胞构建的Nrf2敲减稳定株细胞和Nrf2阴性对照细胞,分别分为Nrf2-KD+JG组、Nrf2-KD+NS组和NC+JG组、NC+NS组。Nrf2-KD+JG组和NC+JG组分别采用10%健骨颗粒含药血清加高糖DMEM培养12 h;Nrf2-KD+NS组和NC+NS组分别采用10%生理盐水血清加高糖DMEM培养12 h,再用10μmol/L过氧化氢干预12 h;采用超氧化物阴离子荧光探针(DHE)检测4组超氧化物阴离子含量,茜素红染色实验观察4组矿化结节数量,Western blot检测4组Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2蛋白相对表达量。结果 与NC+JG组比较,Nrf2-KD+JG组超氧化物阴离子含量增多(P<0.05),显微镜下可见矿化结节数量减少,Nrf2、核Nrf2、HO-1和RUNX2蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05)。与NC+NS组比较,Nrf2-KD+NS组超氧化物阴离子含量增多,显微镜下可见矿化结节数量减少,4个指标蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05),NC+JG组超氧化物阴离子含量显著降低(P<0.05),显微镜下可见矿化结节数量增多,4个指标蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05)。结论 健骨颗粒可以激活成骨细胞内Nrf2/HO-1信号通路,降低细胞内氧化应激水平,增强细胞矿化能力,促进成骨细胞骨形成。

氧化苦参碱水凝胶通过激活角化细胞Nrf2/HO-1通路促进创面愈合

背景:慢性创面炎症和氧化应激阻碍了角化细胞的再生,氧化苦参碱具有抗氧化、抗炎等多种生物活性,可能具有促进创面愈合的潜在效应。目的:探讨氧化苦参碱对创面愈合的作用,以及对H_(2)O_(2)诱导人角质形成细胞系HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用。方法:①体内实验:分别制备含0,0.05,0.1,0.2 g/L氧化苦参碱的甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)水凝胶。在75只糖尿病小鼠背中部制作直径12 mm的全层皮肤缺损模型,随机分5组干预,每组15只:模型组创面包扎固定,单纯水凝胶组以HAMA水凝胶覆盖创面,低、中、高剂量氧化苦参碱组分别以含0.05,0.1,0.2 g/L氧化苦参碱的HAMA水凝胶覆盖创面,光固化后包扎固定,14 d内进行相关指标的检测。②体外实验:将人角质形成细胞系HaCaT分5组培养,正常组常规培养,H_(2)O_(2)组及低、中、高浓度氧化苦参碱组均加入H_(2)O_(2)干预4 h,然后分别更换为含0,0.05,0.1,0.2 g/L氧化苦参碱的培养基,培养24 h后进行相关指标的检测。结果与结论:①体内实验:与模型组比较,单纯水凝胶组小鼠创面愈合率无明显变化,低、中、高剂量氧化苦参碱组治疗后7,14 d的创面愈合率升高(P<0.05)。治疗后14 d的创面样本切片病理观察显示,与模型组相比,中、高剂量氧化苦参碱组再生表皮层厚度、显微血管数量与胶原沉积均增加(P<0.05)。术后7 d的创面样本Western blotting检测显示,与模型组相比,中、高剂量氧化苦参碱组肿瘤坏死因子α与白细胞介素6的蛋白表达降低(P<0.05)。②体外实验:CCK-8检测、EdU及Ki67染色显示,与H_(2)O_(2)组相比,中、高浓度氧化苦参碱组细胞增殖能力明显升高(P<0.05)。与H_(2)O_(2)组相比,中、高浓度氧化苦参碱组线粒体膜电位升高(P<0.05)、活性氧含量降低(P<0.05)。Western blotting检测显示,与H_(2)O_(2)组相比,高浓度氧化苦参碱组Nrf2核蛋白、Nrf2总蛋白、HO-1蛋白及超氧化物歧化酶1蛋白的表达增加(P<0.05)。③结果表明:氧化苦参碱能够通过上调Nrf2、HO-1蛋白减轻HaCat细胞的氧化应激损伤,加速创面愈合。

芹菜素通过激活Nrf2/HO-1通路改善血管性痴呆大鼠的认知功能

[目的]研究芹菜素(APG)对血管性痴呆(VD)大鼠认知功能的保护作用及机制。[方法]通过结扎双侧颈总动脉复制VD大鼠模型,设置假手术组、模型组、APG低剂量组、APG高剂量组和尼莫地平(NMP)组,每组30只。APG低剂量组、高剂量组分别1次/天腹腔注射20、40 mg/kg APG,NMP组1次/天腹腔注射2 mg/kg NMP,假手术组和模型组给予生理盐水,疗程28天。Morris水迷宫实验检测大鼠的认知功能,HE染色和TUNEL染色观察海马体CA1区神经元病理特点和凋亡状况,通过电子显微镜观察神经元超微结构变化,分光光度法检测海马体丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;RT-PCR和Western blot检测海马体核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)mRNA和蛋白的表达。[结果]与模型组相比,APG高剂量组和NMP组大鼠的认知功能明显改善;海马体CA1区神经元数量、形态结构病理学改变、超微结构改变和凋亡状况均明显改善,病理分级和凋亡指数(AI)降低;海马体MDA含量降低,SOD、GSH-Px活性升高,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白的表达升高。APG高剂量组各指标的改善均优于NMP组。[结论]APG对VD大鼠的认知功能具有明显改善作用,可能与APG激活Nrf2/HO-1通路,抑制氧化应激而减轻大脑海马体损伤有关。

六味地黄丸通过Nrf2/HO-1通路抗氧化应激防治阿尔茨海默病的机制研究

目的观察六味地黄丸通过Nrf2/HO-1通路对H_(2)O_(2)诱导海马神经元细胞(HT22)氧化损伤的保护作用,探讨其防治阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)的作用机制。方法(1)以过氧化氢(Hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))诱导HT22细胞,通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,DCFH-DA荧光染色法检测细胞内ROS含量,构建基于氧化应激损伤的早期AD细胞模型;(2)制备六味地黄丸含药血清(Medicated Serum of Liuwei Dihuang Pill,MSLDP),分别设置空白组、模型组、MSLDP组,检测细胞内SOD活力、MDA及ROS含量的变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞内Nrf2、HO-1及NQO1等因子的mRNA的转录水平及蛋白表达量的变化;(3)采用Nrf2的抑制剂(ML385)抑制细胞内Nrf2的激活,RT-qPCR及Western blot法检测各组细胞内Nrf2、HO-1、NQO1等因子mRNA的转录水平及蛋白表达量的变化。结果(1)经H_(2)O_(2)诱导后;随着H_(2)O_(2)诱导浓度的增高和时间的增长,细胞活性逐渐降低,细胞内的ROS含量则逐渐升高,细胞内氧化应激与H_(2)O_(2)诱导浓度和时间呈正相关。(2)模型组细胞内ROS和MDA含量较空白组升高,SOD活力下降,Nrf2与Keap1解离并入核,其下游HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量升高;MSLDP组细胞内的ROS和MDA含量降低,SOD活力升高,Nrf2进一步入核,细胞内Keap1、HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达水平也进一步升高;(3)使用ML385抑制Nrf2后,MSLDP不再上调Nrf2及下游HO-1、NQO1蛋白的转录及表达。结论六味地黄丸对AD模型细胞中的氧化应激具有明显的保护作用,其机制可能是通过调节Nrf2/HO-1通路中抗氧化因子的表达量来实现的。

运动预适应介导氧化应激调控PI3K/Akt和Nrf2/HO-1通路对大鼠认知和学习障碍的影响

目的:探究运动预适应调控PI3K/Akt、Nrf2/HO-1信号通路和氧化应激减轻低氧暴露大鼠认知、学习障碍的基本机制。方法:将60只6周龄SPF级雄性SD大鼠,按照随机数字表法分为对照组、运动组、暴露组和运动+暴露组,每组15只。对照组和暴露组不进行运动预适应干预,运动组与运动+暴露组接受运动预处理干预(跑台训练,2次/d,6 d/周,共训练4周);运动预适应结束次日,暴露组和运动+暴露组大鼠接受7 d低氧暴露。7 d低氧暴露后,采用旷场实验及Morris水迷宫实验评估大鼠认知、学习能力;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清SOD、GSH活性,MDA含量和IL-1β、IL-6、TNF-α水平;通过尼氏染色观察海马CA1区尼氏小体变化;RT-PCR检测PI3K、Nox1、Duox2、Akt mRNA相对表达水平;采用Western blot法检测海马组织Nox1、Duox2、GCLM蛋白及PI3K/Akt、Nrf2/HO-1通路蛋白相对表达量。结果:与对照组和运动组比较,暴露组3 d逃避潜伏期上升(P<0.05),穿越平台次数和平台所在象限停留时间明显降低(P<0.05);血清MDA含量,IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显上升(P<0.05),SOD、GSH活性明显下降(P<0.05);CA1区尼氏小体数量下降(P<0.05);PI3K、Nox1、Duox2 mRNA相对表达水平上升(P<0.05),同时Akt mRNA相对表达水平下降(P<0.05);海马组织Nox1、Duox2、GCLM蛋白相对表达量显著上升(P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值和Nrf2、HO-1蛋白相对表达量明显下调(P<0.05)。与暴露组比较,运动+暴露组中心区域活动时间、3 d逃避潜伏期降低(P<0.05),穿越平台次数和平台所在象限停留时间上升(P<0.05);血清MDA含量,IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显下降(P<0.05),SOD、GSH活性明显上升(P<0.05);CA1区神经元损伤减轻,尼氏小体数量上升;海马组织PI3K、Nox1、Duox2 mRNA相对表达水平下降(P<0.05),Akt mRNA相对表达水平上升(P<0.05);海马组织Nox1、Duox2、GCLM蛋白相对表达量明显降低(P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值和Nrf2、HO-1蛋白相对表达量明显上升(P<0.05)。结论:运动预适应可能通过激活PI3K/Akt和Nrf2/HO-1信号通路参与调节脑组织氧化应激并减轻损伤程度,进而改善低氧暴露大鼠神经行为功能。

Nrf2/HO-1通路通过调控内质网应激改善小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用研究

目的:探讨Nrf2/HO-1信号上调对小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的改善作用及相关机制。方法:小鼠原代心肌细胞分为正常培养处理和缺氧/复氧处理,其中缺氧/复氧处理的心肌细胞分为模型组、Nrf2过表达组、HO-1过表达组、HO-1沉默+Nrf2过表达组。采用MTT法检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞培养上清中心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,荧光定量PCR检测内质网应激相关分子水平。结果:小鼠心肌细胞缺氧/复氧处理后,心肌细胞活性降低、细胞凋亡增加及细胞培养上清中cTnⅠ和CK-MB含量升高(P<0.05)。Nrf2或HO-1过表达可有效减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤(P<0.05)。给予HO-1基因沉默预处理后,Nrf2过表达产生的细胞保护作用明显减弱(P<0.05)。此外,缺氧/复氧处理后,心肌细胞内GRP78、ATF6、CHOP和Caspase-3的mRNA表达量升高(P<0.05)。Nrf2或HO-1过表达引起GRP78、ATF6、CHOP和Caspase-3表达水平下调(P<0.05),而下调HO-1水平可使Nrf2过表达对内质网应激信号转导的抑制作用减弱(P<0.05)。结论:Nrf2/HO-1通路表达上调可有效改善缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤,其机制可能在于抑制内质网应激以及下游的细胞凋亡通路信号转导。

沙棘花青素提取物对双氧水诱导的H1299细胞损伤的保护作用及Nrf2/HO-1通路的影响

目的:研究沙棘花青素提取物(The anthocyanidin extract of Hippophae rhamnoides L.,HRAE)对双氧水诱导H1299细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法:利用双氧水诱导H1299细胞氧化损伤模型,采用MTT法检测HRAE对细胞活力的影响,采用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量;采用试剂盒分别测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathion peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;采用Western Blot法检测血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化还原酶-1(NAD(P)H quinine oxidoreductase 1,NQO1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch like ECH-associated protein 1,Keap1)和核转录因子E2相关因子(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的蛋白质水平;采用相关数据库和软件对沙棘花青素提取物的关键活性成分表儿茶素和儿茶素与氧化应激关键靶点蛋白Nrf2进行分子对接验证。结果:MTT实验表明,在0~800μg/mL浓度范围内HRAE对细胞活力无显著性抑制作用(P>0.05);与模型组相比,给药组中MDA水平下降,SOD、CAT和GSH-Px等活性均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,给药组ROS的含量显著降低(P<0.05);Western Blot显示HRAE可显著(P<0.05)调节HO-1、NQO1、KEAP和Nrf2的蛋白质水平(P<0.05);分子对接结果表明表儿茶素和儿茶素与氧化应激关键蛋白Nrf2具有良好的自由结合活性。结论:沙棘花青素提取物以浓度依赖降低双氧水导致的H1299细胞氧化损伤,其机制可能与促进Nrf2/HO-1信号通路的激活有关。

葛根素干预软骨氧化应激和Nrf2/HO-1通路改善PTOA大鼠软骨退变的机制

旨在研究葛根素干预软骨氧化应激和Nrf2/HO-1通路改善创伤后骨关节炎(post-traumatic osteoarthritis,PTOA)大鼠软骨退变的作用机制,探究葛根素对骨关节炎的治疗作用。将40只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组:对照组(n=8)、模型组(n=8)、塞来昔布组(n=8)和葛根素组(n=16)。葛根素组随机分为低剂量组(n=8)和高剂量组(n=8)。除对照组外,其余各组通过前十字韧带横断(anterior cruciate ligament transection,ACLT)建立大鼠PTOA模型。低剂量组(50 mg·kg^(-1))、高剂量组(100 mg·kg^(-1))和塞来昔布组(2.86 mg·kg^(-1))进行灌胃给药,对照组给予等量生理盐水,连续干预5周。每周进行关节肿胀程度、冷敏感反应和膝关节伸膝发声检测,评估大鼠关节肿胀和疼痛程度。给药结束后,收集各组大鼠膝关节和血清样本。对胫骨和股骨组织进行HE染色和改良的Mankin评分,以评估病理组织学变化。检测大鼠软骨中基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)、基质金属蛋白酶13(MMP13)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶4(ADAMTS4)的水平以及血清中Ⅱ型胶原羧基末端肽(CTX-Ⅱ)和软骨寡聚基质蛋白(COMP)的含量,以评估葛根素对大鼠骨关节炎软骨退变的改善作用。通过检测大鼠血清中抗氧化酶(SOD、GSH-Px和CAT)活力以及大鼠软骨中丙二醛(MDA)含量和Nrf2/HO-1通路水平,以评估葛根素对大鼠机体氧化损伤的保护作用。检测大鼠血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平,以评估葛根素对机体的抗炎作用。结果显示:与模型组比较,使用高剂量葛根素干预可以显著减轻大鼠关节肿胀程度和疼痛反应,改善关节软骨损伤程度,降低Mankin评分(P<0.01),激活软骨中Nrf2/HO-1通路,抑制MDA、MMP3、MMP13和ADAMTS4表达(P<0.05),上调血清中抗氧化酶活力(P<0.01),抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及软骨代谢标志物CTX-Ⅱ和COMP水平(P<0.05)。综上,葛根素通过激活Nrf2/HO-1通路抑制氧化应激与炎症损伤改善PTOA大鼠软骨退变。

转位分子蛋白经由Keap1/Nrf2/HO-1通路激活自噬缓解大鼠糖尿病神经病理性疼痛

目的·探讨转位分子蛋白(translocator protein,TSPO)激动剂Ro5-4864对糖尿病神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain,DNP)大鼠坐骨神经自噬和Kelch样ECH关联蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-derived-2-like 2,Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)通路的影响。方法·通过高脂饮食和链脲佐菌素构建2型糖尿病模型,经行为学筛选获得DNP大鼠。24只大鼠根据数字表随机分配到假手术组(Sham组)、DNP模型组(DNP组)、TSPO激动剂Ro5-4864处理组(Ro组)和TSPO激动剂Ro5-4864合用Nrf2抑制剂ML385处理组(Ro+ML385组)。采用up-down法测量大鼠50%机械缩足反射阈值(paw 50%mechanical withdrawal threshold,50%PMWT),时间点选定为处理前(baseline),处理后第3(D3)、7(D7)、14(D14)、21(D21)和28(D28)天。在最后1天收集坐骨神经,使用免疫荧光和Western blotting分析鞘内注射Ro5-4864对DNP大鼠坐骨神经中自噬相关蛋白和Keap1/Nrf2/HO-1通路相关蛋白的影响。结果·与Sham组相比,DNP组大鼠的50%PMWT自第3天开始大幅下降,全程无改善(各时间点均P=0.000);另外,DNP大鼠坐骨神经中Bcl-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1,Beclin-1)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、HO-1和核Nrf2蛋白的含量显著减少(均P=0.000),p62则显著增加(P=0.000)。鞘内注射Ro5-4864改善了以上损伤,大鼠50%PMWT与DNP组相比逐渐上升(D14 P=0.039,D21和D28均P=0.000),自噬和Keap1/Nrf2/HO-1通路的损伤也被修复,表现为Beclin-1、LC3-Ⅱ、HO-1和核Nrf2蛋白含量的升高(均P=0.000)以及p62含量的降低(P=0.001)。但是,Ro5-4864的效应被ML385完全抑制。结论·TSPO激动剂Ro5-4864缓解了DNP,其作用机制可能与通过对Keap1/Nrf2/HO-1通路的正向调节激活了DNP大鼠坐骨神经中的自噬相关。这可能为治疗DNP提供了一个新的策略。

基于Nrf2/HO-1通路探讨虎杖含药血清对血管内皮细胞铁死亡的干预作用

目的:探讨虎杖含药血清调节Nrf2/HO-1信号通路对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)所诱导血管内皮细胞铁死亡的影响。方法:采用120μg/mL的ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立泡沫细胞模型,分为模型组、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1组及虎杖低、高剂量含药血清组,另设空白血清对照组。药物干预24 h后,通过油红O染色观察内皮细胞泡沫化程度;CCK-8法检测细胞增殖率;透射电镜观察细胞线粒体形态;试剂盒检测细胞SOD、MDA、GSH、Fe^(2+)水平;免疫荧光法检测ROS水平;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内脂质ROS水平;Western Blot测定细胞Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达。结果:油红O染色显示,经ox-LDL诱导后,模型组细胞内可见大量红色脂滴,呈现出典型泡沫细胞形态,提示泡沫细胞模型制备成功。透射电镜下可见模型组线粒体形态变小,虎杖高剂量含药血清组能明显阻止线粒体固缩;与模型组比较,虎杖高剂量含药血清组及Ferrostatin-1组细胞SOD、GSH水平及Nrf2、HO-1、GPX4蛋白表达显著升高,MDA水平、泡沫细胞凋亡率及细胞内ROS和脂质ROS水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:虎杖含药血清能降低ox-LDL诱导的HUVECs氧化应激水平,从而抑制铁死亡,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

肾气丸对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病大鼠保护作用及Nrf2/HO-1通路的影响

目的研究肾气丸对链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠的保护作用及Nrf2/HO-1通路的影响。方法大鼠随机分为正常对照组、糖尿病肾病组、肾气丸低、中、高剂量组及二甲双胍组,12只/组,采用腹腔注射STZ法建立糖尿病肾病大鼠模型,造模完成后,肾气丸各剂量组分别给予4.5、9、18 g/kg的肾气丸,二甲双胍组给予二甲双胍(300 mg/kg),1次/d,连续给药8周,测定大鼠空腹血糖及24 h尿蛋白量,全自动生化分析仪测定糖化血红蛋白、血清尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(Serum creatinine,SCr)水平,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定大鼠肾组织还原型谷胱甘肽(Glutathione SH,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平,苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色法检查大鼠肾组织病理学变化,实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,PCR)测定大鼠肾组织Nrf2及HO-1 mRNA水平,免疫印迹法(Western blot)测定肾组织Nrf2及HO-1蛋白水平,免疫组化法测定大鼠肾组织Nrf2及HO-1平均积分光密度(IOD)值。结果与正常对照组比较,糖尿病肾病组大鼠血糖、糖化血红蛋白、BUN、SCr及24h尿蛋白量,肾组织MDA水平均显著升高(P<0.05),肾组织GSH及SOD水平,肾组织Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白水平,肾组织Nrf2及HO-1免疫组化IOD值均显著降低(P<0.05);与糖尿病肾病组比较,肾气丸各剂量组及二甲双胍组大鼠血糖、糖化血红蛋白、BUN、SCr及24 h尿蛋白量,肾组织MDA水平均显著降低(P<0.05),肾组织GSH及SOD水平,肾组织Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白水平,肾组织Nrf2及HO-1免疫组化IOD值均显著升高(P<0.05),大鼠肾组织病理学显著恢复,且随着肾气丸剂量的增加,各项指标改善更明显。结论肾气丸能够改善糖尿病肾病大鼠肾组织病理性改变,降低大鼠血糖,恢复肾功能,改善大鼠肾组织氧化应激损伤,其机制可能与调节Nrf2/HO-1通路有关。

葛根素通过Nrf2/HO-1通路对青光眼大鼠模型视网膜损伤的保护作用

目的急性青光眼期间视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的死亡会导致视网膜神经的进行性变性和不可逆的失明。葛根素被证实具有抗氧化和抗神经炎症的特性,可保护视网膜免受急性青光眼的伤害。此研究旨在探索其作用机制。方法构建急性青光眼大鼠模型,将大鼠随机分为5组:正常对照组(normal)、SnPP组、I/R组、葛根素(100μmol/L)组和葛根素+SnPP组。I/R、葛根素和葛根素+SnPP组的大鼠采用苏木精和伊红染色评价视网膜状况。ELISA和qRT-PCR法检测TNF-α、IL-1β的水平,蛋白质印迹法检测cleaved caspase-8、Nrf2、HO-1蛋白水平。免疫荧光检测Brn-3a、β3-tubulin和RBPMS的表达;流式细胞术分别检测细胞凋亡和细胞内活性氧的水平。结果葛根素治疗后显著减轻了急性青光眼大鼠的视网膜损伤和RGCs死亡,视网膜中活性氧和炎性细胞因子的产生显著减少。此外,葛根素处理直接降低了ROS的产生,并重新平衡了细胞内的氧化还原状态,从而有助于RGCs在体外的存活。葛根素治疗也减少了体外炎性细胞因子的产生。从机制上讲,葛根素通过调节Nrf2/HO-1通路,抑制RGCs的细胞凋亡和炎性细胞因子产生。此外,当使用HO-1抑制剂SnPP时,葛根素介导的急性青光眼的神经保护作用被消除。结论研究确定了RGCs凋亡的潜在机制,葛根素作为一种新的治疗剂,对急性青光眼具有神经保护作用。

藏红花素调控Nrf2/HO-1通路对痔疮模型大鼠肛周病理组织形态及炎症反应的影响

目的 探讨藏红花素对痔疮模型大鼠肛周病理组织形态及炎症反应的影响以及核转录因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧-1(HO-1)通路发挥的作用。方法 采用醋酸贴敷法构建大鼠急性痔疮模型;将造模成功大鼠分为模型组、阳性组和低、中、高剂量(L、M、H)藏红花素组、藏红花素+ML385(Nrf2抑制剂)组,每组10只,并取10只大鼠设为对照组;给药1周后,肛周组织病变评分;ELISA检测血清中炎症因子水平;血常规检测血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞水平;HE染色检测肛周病理组织形态变化;Western blot检测肛周组织中Nrf2、HO-1蛋白水平。结果 与对照组比较,模型组大鼠肛周黏膜上皮坏死、有出血、炎性细胞浸润,肛周组织病变评分、血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平,血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数显著升高,肛周组织Nrf2、HO-1蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,阳性组肛周组织病变评分、血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平、藏红花素-L、M、H组大鼠肛周组织损伤明显改善,腺体整齐排列、炎性浸润减轻、出血减轻,肛周组织病变评分、血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平,血液白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数显著降低,肛周组织Nrf2、HO-1蛋白水平显著升高,呈剂量依赖性(P<0.05);与藏红花素-H组比较,藏红花素+ML385组大鼠肛周组织严重受损,炎性细胞浸润,肛周组织病变评分[(5.12±0.62)分]、血清中IL-1β[(121.65±9.32)pg/mL]、TNF-α[(184.65±10.65)ng/L]、IL-6[(129.36±10.67)pg/mL]水平升高,血液白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数也显著升高,肛周组织Nrf2、HO-1蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论 藏红花素可通过激活Nrf2/HO-1通路有效缓解急性痔疮大鼠肛周病理组织形态,降低炎症反应。

穿心莲内酯通过Nrf2/HO-1通路对脑出血大鼠血-脑脊液屏障的保护作用

目的探讨穿心莲内酯(andrographolide,AND)对脑出血大鼠血-脑脊液屏障(blood-brain barrier,BBB)的保护作用及机制。方法采用自体血注射法制备脑出血大鼠模型,分别1次/天灌胃给予0.9%氯化钠溶液(模型组)、尼莫地平(NMP)10mg/kg或AND低、中、高剂量(25、50、100mg/kg)进行治疗,疗程7天;另设假手术组。根据mNSS行神经功能缺失评分;测定脑血肿体积、脑含水量和BBB通透性;分光光度法检测氧化应激指标,ELISA法检测炎性细胞因子水平,Western blot法检测Claudin-5、Occludin、ZO-1、Nrf2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、核因子(nuclear factor,NF)-κB、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9表达。结果与假手术组比较,模型组神经功能缺失评分、脑血肿体积、含水量、BBB通透性升高(P<0.01);丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis facter,TNF)-α水平升高,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性降低(P<0.01);Claudin-5、Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1表达量降低而NF-κB、MMP9表达量升高(P<0.01)。与模型组比较,AND中、高组剂量和NMP组神经功能缺失评分、脑血肿体积、含水量、BBB通透性降低(P<0.05或P<0.01);MDA含量和IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,SOD、CAT活性升高(P<0.05或P<0.01);Claudin-5、Occludin、ZO-1、Nrf2、HO-1表达量升高且NF-κB、MMP9表达量降低(P<0.05或P<0.01);AND高剂量组效果优于NMP组(P<0.05或P<0.01)。结论AND对脑出血大鼠BBB结构和通透性具有保护作用,可能与激活Nrf2/HO-1通路,抑制氧化应激和炎性反应、下调MMP9表达有关。