针对HO-2基因的四种RNA干扰序列构建和效应观察

目的:构建和筛选出血红素氧合酶-2(HO-2)基因的RNA干扰载体,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。方法:根据小鼠HO-2基因的c DNA序列设计了4个HO-2基因干扰序列,克隆到干扰载体p GPU6-GFP-Neo上,利用电穿孔法将干扰载体对小鼠脑血管内皮细胞进行转染。Real-time PCR和Western Blot检测小鼠脑血管内皮细胞中HO-2的表达。结果:干扰载体显著抑制小鼠脑血管内皮细胞中HO-2的表达,其中干扰载体p GPU6-GFP-Neo-HO-2-mus-768对HO-2 mRNA的表达抑制达显著水平(P<0.01),蛋白的表达抑制达显著水平(P<0.05)。结论:成功构建并筛选了HO-2表达干扰载体,为下一步的HO-2基因的功能鉴定奠定了基础。

亚低温对脓毒症小鼠肺损伤及Nrf2/HO-1通路的影响

目的:探究亚低温对脓毒症小鼠肺损伤及核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)通路的影响。方法:野生型(WT)和Nrf2基因敲除(Nrf2-KO)C57/BL6小鼠各20只,分别随机分为假手术常温组(S组)、假手术亚低温组(SH组)、脓毒症常温组(N组)和脓毒症亚低温组(H组),每组5只。采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型。采用苏木精—伊红(HE)染色观察肺组织损伤情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平,试剂盒检测肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。分别采用western blotting和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肺组织中Nrf2和HO-1基因及蛋白表达。结果:与S组相比,WT和Nrf2-KO小鼠N组TNF-α、IL-1β和MDA含量升高,HO-1 mRNA及蛋白表达量升高,SOD活性降低(均P<0.05),肺组织损伤严重。WT小鼠N组Nrf2 mRNA及蛋白表达量较S组升高(P<0.05),而Nrf2-KO小鼠各组Nrf2均无表达。与N组相比,WT小鼠H组TNF-α、IL-1β和MDA含量降低,SOD活性升高,Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达量升高(均P<0.05),肺组织损伤减轻;而Nrf2-KO小鼠H组与N组上述各指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:亚低温可以减轻脓毒症小鼠肺损伤,其机制可能与激活肺组织Nrf2/HO-1通路,增强抗氧化应激能力,以及减少炎症因子的生成有关。

抑癌基因DOC-2对卵巢癌细胞增殖的影响

目的:探讨抑癌基因DOC2对卵巢癌细胞系HO8910在生长代谢、超微结构及细胞周期等方面的影响及其作用机制。方法:实验分3组:卵巢癌细胞系HO8910、8910P93(转染并表达DOC2基因)、8910pcDNA3.1(转染空载体pcDNA3.1),通过细胞消化计数法和3HTdR掺入法分别测定3组细胞的生长曲线及DNA合成代谢情况;利用透射电镜对细胞的超微结构进行观察比较;最后利用流式细胞仪观察卵巢癌细胞转染前后细胞周期的变化。结果:8910P93在生长增殖及DNA合成方面均明显低于HO8910和8910pcDNA3.1(P<0.05),而后两者之间无明显差异;电镜结果显示,8910P93存在内质网扩张,线粒体空泡化,溶酶体增生,部分细胞可见染色质边集等凋亡前期改变;细胞周期检测结果显示,处于G1和G2期的8910P93细胞明显增多而S期细胞明显减少。结论:抑癌基因DOC2可通过改变卵巢癌细胞的形态及细胞周期而明显抑制细胞的增殖。

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2(HO-2)真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高(P<0.01),在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高(P<0.05)。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。