针对HO-2基因的四种RNA干扰序列构建和效应观察

目的:构建和筛选出血红素氧合酶-2(HO-2)基因的RNA干扰载体,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。方法:根据小鼠HO-2基因的c DNA序列设计了4个HO-2基因干扰序列,克隆到干扰载体p GPU6-GFP-Neo上,利用电穿孔法将干扰载体对小鼠脑血管内皮细胞进行转染。Real-time PCR和Western Blot检测小鼠脑血管内皮细胞中HO-2的表达。结果:干扰载体显著抑制小鼠脑血管内皮细胞中HO-2的表达,其中干扰载体p GPU6-GFP-Neo-HO-2-mus-768对HO-2 mRNA的表达抑制达显著水平(P<0.01),蛋白的表达抑制达显著水平(P<0.05)。结论:成功构建并筛选了HO-2表达干扰载体,为下一步的HO-2基因的功能鉴定奠定了基础。

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2(HO-2)真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高(P<0.01),在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高(P<0.05)。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。

血红素加氧酶：一种血红素代谢酶及其近况

血红素加氧酶(HO)是胆红素形成过程中的第一种酶，也是一种限速酶，这种酶可使血红蛋白或其它含有血红素的蛋白质中的血红素降解形成胆绿素。这是一种需能过程，因为在降解过程中卟啉环中的铁离子的游离、一氧化碳(CO)的释放和胆绿素的生成，均需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)通过细胞色素C P450系统提供电子，并需要消耗分子氧(图1)。在微粒体酶－胆绿素还原酶的作用下，胆绿素还原形成胆红素。肝细胞微粒体分析证实，在反应底物－氯化血红素的存在时，HO的活性增加［1］，其它化合物，如氯化钴和各种重金属，均能使HO的活性上调［1，2］。Maines［3］在研究中发现了血红素代谢酶的一种发展形式，由此可以解释新生儿黄疸中胆红素过多生成的原因。另外，已经发现纯化和特性更好的32 kd的HO-1蛋白。随着金属卟啉的合成，HO的活性被抑制，从而可以更进一步了解HO活性的细胞结果，并可改进防止新生儿高胆红素血症的措施。20世纪80年代，发现了血红素加氧酶HO-2的组成形式［4］。20世纪80年代末期，发现了调控HO-1的基因调节。Shibahara等［5］在转录水平证实了进行HO-1的诱导。随着在这项领域的研究进展，人们已经注意到HO-1的基因诱导是氧应激的一种普遍标记［6］。目前，HO-1诱导反应的普遍性已经更清楚。随着分子生物学和分子遗传学技术的不断进步，HO的生化特性、作用和调节机制将越来越清楚。