转酿酒酵母HOG1基因拟南芥植株的获得与检测

HOG1(high osmolarity glycerol,HOG1)是酵母中参与耐高渗透压调控的重要基因。根据已发表的酿酒酵母序列,设计特异引物,扩增到完整的HOG1基因;构建植物表达载体pBI121-HOG1,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR和RT-PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥,并获得了13份转HOG1基因苗。

HOG1基因对白念珠菌超微结构的影响

目的探讨HOG1基因对白念珠菌超微结构的影响。方法设置实验组、HOG21组(hog1/hog1双等位基因缺陷株);对照组、WT组(标准株),分别在扫描电镜及透射电镜下观察两组菌株细胞的超微结构。结果扫描电镜下观察两组细胞均呈圆形或椭圆形,呈多边出芽繁殖的生长方式。但HOG1基因缺陷株细胞表面粗糙、凹凸不平,出芽数目比标准株少;标准株细胞表面光滑,出芽数量较多,可见"花瓣样"结构的芽痕;透射电镜下HOG1基因缺陷株细胞壁结构不完整,电子透明层厚薄不一,部分细胞可见棉絮状电子致密外层局灶性缺失、细胞膜外凸、不连续以及细胞膜周围见囊泡聚集等现象。标准株细胞壁各层结构完整。结论HOG1基因对白念珠菌细胞壁结构具有一定影响。

HOG1对格特隐球菌应对压力应激、毒力因子和抗药性的影响

目的:明确HOG1基因对格特隐球菌应对压力应激、毒力因子产生和抗药性的影响。方法:比较格特隐球菌原始株、hog1Δ菌株和重建株在含高渗透压培养基、抗真菌药物培养基中的生长差异,以及在YEPD培养基中荚膜的合成和咖啡因培养基中黑素产生的差异。结果:hog1Δ菌株在高压力和抗真菌培养基中生长受限,在YEPD培养基中荚膜合成减弱,在咖啡因培养基中黑素生成减少。结论:HOG1基因在格特隐球菌应对压力应激、毒力因子产生、抗药性中有重要作用。

格特隐球菌HOG1基因的敲除及重建

目的构建格特隐球菌HOG1基因缺陷株和HOG1基因重建株。方法从格特隐球菌基因组扩增HOG1基因,通过部分基因缺失方法,获得缺陷基因dHOG1。将获得的HOG1基因及其缺陷基因dHOG1分别亚克隆到真核表达载体pGAPzα-A,构建pGAPzα-HOG1及pGAPzα-dHOG1质粒。将pGAPzα-dHOG1质粒转染隐球菌原始株,通过筛选获得HOG1基因缺陷菌株;同样方法将pGAPzα-HOG1质粒转染格特隐球菌HOG1基因敲除菌株,获得HOG1基因重建株。结果 RT-PCR结果示:格特隐球菌HOG1基因缺陷株不转录表达完整的HOG1基因,而HOG1基因重建株可以转录表达完整的HOG1基因片段。结论成功获得格特隐球菌HOG1缺陷株和HOG1基因重建株,为后续格特隐球菌毒力和致病机制的研究奠定了基础。

橡胶树炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表达分析

HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsHog1基因,构建GST-CsHog1融合表达载体,利用SDS-PAGE和WesternBlot检测蛋白表达情况。结果表明:橡胶树炭疽菌(C.siamense)的CsHog1基因大小1383 nt,编码459个氨基酸,包含5个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1(Hog1同源基因)同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28℃)均可较好诱导表达,GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。

油茶(Camellia oleifera)果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)Hog1基因功能和致病性分析

为了探讨Hog1基因在油茶果生刺盘孢菌(Colletotrichum fructicola)致病过程中的作用。本研究以酿酒酵母中的Hog1基因为依托,进行BlAsTP比对分析油茶果生刺盘孢菌的全基因组数据,以获取与其高度同源的Hog1蛋白序列,通过对ATMT体系进行改进和调整,建立了炭疽病菌基因敲除体系。采用形态观察、显微鉴定、生物学表型分析方法,基于科赫法则(Koch postulates),检测病原菌的致病力大小。结果表明,本试验成功敲除了C.fructicola野生型菌株CFLH16 Hog1基因,发现突变体菌株ΔC.f Hog1与CFLH16相比,其产孢量显著下降,且无法形成附着胞,基本丧失致病能力;ΔC.f Hog1对盐胁迫(NaCl)与CFLH16相比其敏感性显著降低,对细胞壁胁迫(SDS)和过氧化物胁迫(H2O2)与CFLH16相比其敏感性不明显。研究发现C.f Hog1基因编码的蛋白质是果生刺盘孢菌生长发育过程中一个重要蛋白,参与调控病菌的附着胞形成、致病过程以及对外界胁迫的应答。本试验针对油茶炭疽病害的功能基因进行探索,为油茶病害分子机制研究提供了参考依据,为进一步实现油茶病害有效调控的目标打下了基础。