牦牛HOXA1基因的时空表达及其对机体调控机制的研究

试验旨在获得牦牛HOXA1基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达谱和时序表达谱,为进一步研究多脊椎骨形成的原因及其机制奠定基础。通过RT-PCR技术克隆多脊椎骨牦牛HOXA1基因,利用半定量RT-PCR技术检测该基因在多脊椎骨牦牛组织中的表达情况,利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在多脊椎骨牦牛不同发育时期各组织中的表达情况。RT-PCR结果表明,多脊椎骨牦牛HOXA1基因序列全长为885bp,其中开放阅读框（ORF）为870bp,编码290个氨基酸。同源性分析表明,牦牛与普通牛、野牦牛、人、野猪、马、家鼠、黑猩猩、原鸡和野猪的同源性为75.4%~98.1%。组织表达分析表明,HOXA1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、子宫、输卵管、乳腺、睾丸中均有不同程度的表达;时序表达分析表明,随着年龄的增长HOXA1基因在多数组织中的表达量呈逐渐升高趋势。

HOXA1基因反义寡核苷酸对结直肠癌细胞转移潜能的影响研究

目的探讨HOXA1基因反义寡核苷酸(ASODN)对结直肠癌HCT116细胞侵袭和迁移的影响及机制。方法将HCT116细胞分为:15 μmol/L的 HOXA1 ASODN处理组(ASODN组)、15 μmol/L N-ODN处理的无关对照组(N-ODN组)、15 μmol/L的HOXA1 SODN处理的正义对照组(SODN组)及正常对照组。Western blotting检测HOXA1、上皮型钙黏附素(E-cadherin)、神经型钙黏附素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和磷酸化丝氨酸苏氨酸激酶(p-AKT)蛋白表达。MTT法检测细胞活力。Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力。对比四组上述各指标。结果与其他三组相比较,HOXA1 ASODN组可明显下调HOXA1、N-cadherin、Vimentin、PI3K和p-AKT蛋白表达,上调E-cadherin蛋白表达,抑制细胞活力、侵袭和迁移能力。结论 HOXA1基因反义寡核苷酸可明显降低结直肠癌细胞转移潜能,机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路,从而逆转上皮间质转化有关。

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

目的探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。方法采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸(N-ODN)链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组(5、10、15μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞)、对照组(细胞常规培养,不进行细胞转染)、SODN组(细胞转染15μmol/L的SODN)和N-ODN组(细胞转染15μmol/L的N-ODN)。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-AKT)、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。结果与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低(P<0.05)。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、NODN组比较差异有统计学意义(P<0.05)。15μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高(P<0.05)。结论 HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路可能有关。

HOXA1基因在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨同源异形盒基因A1(HOXA1)基因在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)患者组织中的表达情况与临床特征及预后相关性。方法:从NCBI(美国国立生物技术信息中心)的GEO数据库下载OSCC相关芯片数据(GSE42743),包含74例OSCC样本及29例正常口腔黏膜样本,分析HOXA1基因在二者之间的表达情况;收集73例OSCC组织的基因表达谱及相关临床数据,对样本中的HOXA1基因表达数据及其对应的临床信息进行相关性分析,生存分析HOXA1基因与OSCC总生存期及特异性生存期的相关性;采用基因集富集分析方法探讨HOXA1基因在OSCC中可能的作用机制。结果:OSCC组织中HOXA1基因表达水平明显高于正常黏膜组织(P<0.05);73例OSCC样本中,HOXA1基因表达水平与T分期、CN分期、AJCC分期显著相关(P<0.05);生存分析示HOXA1高表达患者预后明显差于HOXA1低表达组(P<0.05);基因富集分析提示,HOXA1基因高表达样本主要富集了E2F、MYC、m TORC1信号通路及G2M检查点、有丝分裂、蛋白分泌功能基因集,影响OSCC的生物学过程。结论:HOXA1基因高表达与OSCC患者的进展相关,可作为其独立预后危险因素。

miR-99a对宫颈癌Hela细胞增殖影响机制研究

目的 miR-99a在宫颈癌等多种肿瘤组织中异常表达,且与肿瘤细胞的多种生物学行为密切相关。本研究旨在探讨miR-99a沉默HOXA1表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖的影响及相关机制。方法通过瞬时转染将miR-99a mimics导入宫颈癌Hela细胞,采用MTT法和平皿克隆形成实验观察miR-99a增加对Hela细胞增殖的影响;应用Targetscan 6.2软件预测miR-99a与HOXA1基因3’UTR的靶向性作用,荧光素酶报告基因分析miR-99a对HOXA1基因表达的影响,采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测miR-99a对HOXA1表达的作用;构建HOXA1干扰载体,转染Hela细胞,筛选后利用MTT法和平皿克隆实验观察HOXA1表达降低后对Hela细胞增殖的影响。结果 miR-99a被导入宫颈癌Hela细胞后,细胞的生长速度减慢,miR-99amimics组Hela细胞克隆数为156±30,与miR-ctr组(386±49)比较,克隆数减少,F=26.093,P=0.001。采用Targetscan6.2(http://www.targetscan.org/)软件分析miR-99a与HOXA1基因的作用位点发现,miR-99a与HOXA1基因3’UTR的1 485~1 497位核苷酸位点存在结合,miR-99a表达后,抑制Hela细胞中HOXA1的表达。干扰HOXA1表达后,Hela细胞生长速度减慢,平皿克隆形成能力降低,siHOXA1克隆数为165±35,si-control克隆数为390±46,P<0.05。结论miR-99a与HOXA1基因3’UTR 1 485~1 497位核苷酸位点结合沉默其表达,抑制宫颈癌Hela细胞的增殖。

双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁猪动物模型的鉴定及其应用

目的对双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁的猪进行鉴定，探讨其作为动物模型在整形外科的应用。方法以1头二花脸公猪和1头沙子岭母猪为祖代个体，构建F2近交群体。对患病和表型正常个体的外耳形态进行检查。选取1头正常个体和1头它的全同胞双侧外耳缺失的患病个体，行颞部CT扫描，并对HOXAl基因突变进行检测。结果二花脸×沙子岭F2近交群体中，75头F2个体中有57头表型正常个体和18头患病个体。患病个体为双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁，颞部CT显示为双侧外耳道闭锁、中耳结构发育不良；基因检测结果为HOXAl纯合突变。结论HOXAl基因纯合突变的猪动物模型，符合人类双侧小耳畸形特征，为其进一步在小耳畸形病理机制中的应用提供了理论基础。