利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除HOXA5基因对急性髓系白血病细胞增殖的影响

目的:通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的急性髓系白血病(AML)细胞株,明确HOXA5基因敲除对AML细胞增殖的影响,初步探索HOXA5基因在AML发病中的作用。方法:通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术分别检测血液系统非肿瘤患者与初诊AML患者骨髓单个核细胞(BMMC)中HOXA5的表达;应用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建稳定敲除HOXA5基因的AML细胞株KO-HOXA5-THP-1,通过qRT-PCR和Western blot检测KO-HOXA5-THP-1细胞中HOXA5的表达,并采用CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与血液系统非肿瘤患者相比,初诊AML患者骨髓单个核细胞中HOXA5基因及蛋白水平均显著升高(P<0.05)。应用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够获得稳定敲除HOXA5基因的细胞株,而且敲除HOXA5基因后的THP-1细胞株的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论:HOXA5在AML细胞中高表达,敲除HOXA5能够显著影响AML细胞的增殖能力,这为急性髓系白血病的精准治疗提供了一个新的潜在治疗靶点。

下调HOXA5表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响

目的探讨下调同源异型盒基因A5(HOXA5)表达对胶质瘤细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法应用生信分析方法,计算机检索CGGA数据库,下载m RNAseq-693和m RNAseq-325芯片数据,获取低级别胶质瘤(WHO分级Ⅱ级)和高级别胶质瘤(WHO分级Ⅲ、Ⅳ级)HOXA5 m RNA表达及病人生存信息;以HOXA5表达水平的平均值为界限,将高级别胶质瘤分为低表达组和高表达组。体外培养人胶质瘤细胞株U87和U251,使用Lipofectamine 2000法将HOXA5 si RNAs和阴性对照si RNAs分别转染U87和U251细胞;CCK-8和平板克隆形成实验评估胶质瘤细胞的增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期;免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果生信分析结果显示:高级别胶质瘤HOXA5表达水平均显著高于低级别胶质瘤(P<0.01);HOXA5高表达组高级别胶质瘤病人中位生存时间较低表达组明显缩短(P<0.01)。体外细胞实验结果:敲低HOXA5表达,U87和U251细胞的增殖率和克隆集落数量显著降低(P<0.01),U87和U251细胞G0/G1期细胞百分比显著增高(P<0.01),U87和U251细胞CDK4蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论胶质瘤HOXA5呈高表达,病理级别越高,表达水平越高,病人生存预后越差。敲低HOXA5表达,明显降低CDK4表达,使细胞周期停滞在G0期,明显抑制胶质瘤细胞的增殖。

确山黑猪HOXA5基因组织表达及生物信息学分析

【目的】探究确山黑猪HOXA5基因的组织表达情况和HOXA5蛋白的结构功能。【方法】利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术检测HOXA5基因在确山黑猪各组织中的表达情况,并与大白猪皮下脂肪和背最长肌进行对比;以确山黑猪皮下脂肪组织为cDNA模板,克隆确山黑猪HOXA5基因编码(coding sequence,CDS)区序列,利用生物信息学软件分析确山黑猪HOXA5基因CDS区序列及其编码蛋白质的结构和功能。【结果】HOXA5基因在确山黑猪肺脏中表达量最高,其次是肝脏和皮下脂肪,且显著高于其他组织。同时,HOXA5基因在确山黑猪皮下脂肪组织中表达量显著高于大白猪。通过对确山黑猪HOXA5基因进行克隆及生物信息学分析,获得的确山黑猪HOXA5基因CDS区全长813 bp,编码270个氨基酸,与牛、绵羊、马、黑猩猩、小鼠、人和鸡的同源性分别为99.1%、99.0%、98.8%、97.8%、97.4%、95.6%和81.3%。确山黑猪HOXA5蛋白分子质量为29.28 kD,主要位于细胞核内,属于酸性、亲水性蛋白,且不具有跨膜结构和信号肽;在二级结构和三级结构中,HOXA5蛋白由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,为混合型蛋白,以无规则卷曲为主。【结论】HOXA5基因作为调控猪脂肪沉积的候选基因,在确山黑猪品种的改良中具有重要意义。

敖汉细毛羊Hoxa5、BMPR1B基因互作研究

旨在构建敖汉细毛羊Hoxa5、BMPR1B基因的质粒及共转染成纤维细胞后,通过基因表达量变化研究两基因的互作。以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA,参照GenBank中Hoxa5、BMPR1B基因序列信息分别设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Hoxa5、BMPR1B基因片段,将得到的Hoxa5、BMPR1B基因分别连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-Hoxa5、pEASYTM-T1-BMPR1B重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。其次,对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Hoxa5、BMPR1B基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B构建成功,并且共转染成纤维细胞BMPR1B基因的表达量明显下降,Hoxa5基因的表达量明显升高且共转染组的表达量极显著地高于单转染组(P<0.01)。成功构建了敖汉细毛羊Hoxa5、BMPR1B基因的质粒,并且成功共转染成纤维细胞,Hoxa5基因的表达量明显升高,BMPR1B基因的表达量明显下降,因而Hoxa5基因抑制了BMPR1B基因的表达,BMPR1B基因促进了Hoxa5基因的表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。

miR-27a-3p靶向HOXA5基因通过Wnt/β-catenin信号通路调控糖尿病患者创面愈合

目的:研究微小RNA-27a-3p(miR-27a-3p)对糖尿病患者创面愈合的影响及作用机制。方法:采用qPCR和Western blot检测糖尿病患者创面愈合组织中miR-27a-3p、同源异型盒基因A5(HOXA5)mRNA和HOXA5蛋白的表达。使用高糖处理人微血管内皮细胞(HMECs),模拟糖尿病HMECs的损伤。在HMECs中转染miR-27a-3p mimic或HOXA5 siRNA,并进行高糖处理,MTT法测定细胞活力,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot法测定HOXA5、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和β-连环蛋白(β-catenin)蛋白的表达。StarBase预测结合双萤光素酶活性检测分析miR-27a-3p和HOXA5的靶向关系。在HMECs中共转染miR-27a-3p mimic和pcDNA-HOXA5,并使用高糖处理,观察其对细胞活力、迁移和侵袭能力的影响。结果:糖尿病患者创面愈合组织中miR-27a-3p的表达量明显减少,HOXA5的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。高糖诱导的HMECs中miR-27a-3p的表达量、细胞活力、细胞迁移和侵袭数量及cyclin D1、MMP2和MMP9的蛋白水平均显著降低(P<0.05)。高表达miR-27a-3p或低表达HOXA5明显增加高糖处理HMECs的细胞活力、迁移和侵袭能力及cyclin D1、MMP2和MMP9的蛋白表达量(P<0.05)。miR-27a-3p靶向调控HOXA5表达。高表达HOXA5可以部分消除miR-27a-3p mimic对高糖处理的HMECs活力、迁移和侵袭能力以及cyclin D1、MMP2、MMP9和β-catenin蛋白表达的影响。结论:miR-27a-3p靶向HOXA5基因,并通过Wnt/β-catenin信号通路促进高糖诱导的微血管内皮细胞生长、迁移和侵袭,从而促进糖尿病患者的创面愈合。

ATRA对K562细胞HOXA5基因表达与细胞周期、凋亡的影响

目的本研究旨在通过全反式维甲酸(ATRA)对人髓系白血病细胞株K562细胞的干预来分析同源盒基因(HOX)A5的表达变化及其与细胞周期、凋亡的关系,探讨HOXA5在髓系白血病发生、发展过程中的作用,为临床治疗白血病提供实验依据。方法通过细胞增殖-毒性实验(CCK-8)筛选出ATRA干预K562细胞的最佳浓度值。流式细胞术检测10μmol/LATRA分别干预K562细胞24 h、48 h和72 h后,各组细胞的凋亡情况及细胞周期分布的变化。实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹法测定K562细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达情况,并分析HOXA5 mRNA及蛋白的表达与细胞周期、凋亡的关系。结果 K562细胞中可以检测到HOXA5 mRNA及蛋白的表达,ATRA干预K562细胞后HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高,细胞凋亡率明显增加(P<0.05),细胞增殖周期被阻抑在G_0/G_1期,细胞增殖受抑,且HOXA5 mRNA及蛋白的表达量与细胞凋亡率呈正相关(r=0.944,r=0.826),与细胞周期G0/G1期增加百分比呈正相关(r=0.870,r=0.962),与S期降低百分比呈负相关(r=-0.946,r=-0.926)。结论 ATRA干预K562细胞后,细胞中HOXA5 mRNA及蛋白的表达量升高;ATRA可能通过上调HOXA5 mRNA及蛋白的表达抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡。

人类巨细胞病毒对粒单系祖细胞分化过程中HOXB6、A5基因的影响

目的探讨人类造血干细胞(HSPC)向粒单系(CFU-GM)增殖过程中HOXB6、A5基因的表达情况,及人类巨细胞病毒(HCMV)对其的影响。方法采用real-timePCR技术测定正常对照组与HCMV组HSPC向CFU-GM增殖过程中HOXB6、A5基因的表达水平。结果①HOXA5基因表达多为阴性,HOXB6基因在增殖过程的第3天开始表达,第7天增高,第12天显著降低(P<0.05)。②相对于正常组,HCMV感染组HOXB6基因表达下调(P<0.05)。结论HOXA5可能不是人类HSPC向CFU-GM增殖分化过程的主控基因;HOXB6是人类HSPC向CFU-GM定向分化的主控基因之一,其表达呈现时间规律性;HCMV干扰的细胞组HOXB6表达下调的同时,其细胞集落生成较正常组差。提示HCMV可能通过调控HOXB6基因表达异常,引起造血干细胞增殖分化异常。

HOXA5基因与肿瘤

HOXA5作为同源盒（HOX）基因家族的一员，在多器官中都有表达，具有调节基因表达、细胞分化和机体形态发生的功能，其结构和（或）功能异常与白血病、乳腺癌、脑血管瘤、肝细胞癌等肿瘤的发生密切相关。研究HOXA5与肿瘤的关系有助于肿瘤的诊断、治疗及预防。

同源盒基因与血管重构的相关研究进展

血管重构是血管壁结构的生理及病理性改变,主要涉及血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等的增殖、迁移、凋亡,以及细胞外基质的合成、降解等过程。同源盒基因与胚胎心血管系统形成、成年人血管重构的过程以及血管内皮细胞、血管平滑肌细胞功能失调有关。本文就血管重构及其相关疾病与同源盒基因家族成员的相关研究进展予以综述。