miR-196a靶向调控HOXA9基因的实验研究

目的:研究HOXA9基因的表观遗传学调控机制,筛选靶向调控HOXA9基因的microRNA。方法:利用Tar-getscan在线分析软件预测特异性靶向HOXA9基因3'端非编码区域(3’UTR)的microRNA,采用PCR方法从1例健康供者DNA中扩增HOXA9基因3’UTR序列,插入经XbaI和PstI双酶切的荧光素酶报告载体pGL3-M,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶重组质粒及microRNA表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。构建miR-196a结合位点突变的HOXA9基因3’端非编码区域突变型荧光素酶报告载体,采用脂质体SuperFect包裹荧光素酶突变型重组质粒及miR-196a表达质粒转染293T细胞,应用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。miR-196amimics以脂质体Hiperfect转染至MV4-11细胞,实时定量PCR及Westernblot检测HOXA9mRNA及蛋白的表达。结果:成功构建了含有1628bp的HOXA9基因3’UTR序列的荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9-3’UTR,并通过酶切及基因测序方法的鉴定;荧光素酶报告实验提示miR-196a组荧光素酶活性明显低于对照组。成功构建了miR-196a的2个结合位点突变的HOXA9基因3’UTR序列的突变型荧光素酶报告重组质粒pGL3-HOXA9-mut3’UTR,并通过基因测序方法的鉴定。miR-196a可以下调野生型质粒的荧光素酶活性,不影响突变型质粒的荧光素酶活性。MV4-11细胞中过表达miR-196a,可以明显下调HOXA9mRNA及蛋白表达。结论:miR-196a通过靶向结合HOXA9基因3’UTR的结合位点特异调控HOXA9基因。

人类巨细胞病毒对粒系祖细胞分化过程中HOXA9基因表达的影响

目的探讨脐血造血干祖细胞(HSPC)向粒系祖细胞(CFU-G)增殖过程中HOXA9基因表达情况,并且用人类巨细胞病毒(HCMV)进行干扰,探讨HCMV对HOXA9基因的影响。方法体外定向培养CFU-G,经MTT法检测后,HCMV-AD169滴度为106蚀斑形成单位(PFU)/mL,按0.1mL105PFU/mL接种培养体系。采用RT-PCR技术测定HOXA9基因表达。结果随时间推移,HOXA9基因在增殖分化的第7天表达最强烈,第12天表达明显减弱;HOXA9基因受HCMV影响下调(P<0.05)。结论 HOXA9基因在脐血粒系祖细胞发育过程中呈规律表达,提示HOXA9基因与粒系造血活动有相关性;HCMV下调HOXA9表达的同时,HCMV干扰细胞集落生成较正常组差,提示HCMV可能通过调控HOXA9基因表达异常引起HSPC增殖分化异常。

siRNA干扰沉默HOXA9基因对急性白血病K562细胞凋亡的影响

白血病是一种发生于造血组织的恶性疾病,其特点是某一类型白血病细胞在骨髓组织或其他造血组织中呈肿瘤性增生。白血病发病率占儿童恶性肿瘤的第一位。在我国白血病的患者30%是儿童。急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）约占儿童急性白血病的20%,过去20年,5年生存率已上升至60%[1]。

铅对造血干细胞和生殖细胞Hoxa9基因表达的影响

目的观察铅对大鼠骨髓和睾丸组织Hoxa9基因表达的影响,探讨其毒性作用机制。方法选用Wistar大鼠20只,随机分为2组,每组10只分别为铅组和对照组。铅组给予0.2%醋酸铅水溶液自由饮用,对照组给予蒸馏水。结果①铅组大鼠游泳时间显著低于对照组(P<0.01);②铅组大鼠睾丸组织显著萎缩,细胞凋亡、坏死明显,可见凋亡小体;③铅组大鼠骨髓和睾丸组织标本着色较浅,Hoxa9mRNA阳性细胞较少。铅组骨髓和睾丸组织Hoxa9mRNA表达率显著低于对照组。结论铅可影响骨髓和睾丸组织Hoxa9基因表达,引起贫血,产生生殖毒性。

经口铅摄入引起大鼠脑损害及对Hoxa9基因表达的影响

目的观察铅对大鼠脑组织Hoxa9基因表达及学习记忆的影响,探讨铅毒性作用机制。方法选用雄性Wistar大鼠30只,随机分为3组,每组10只,分别为低铅组、高铅组和对照组。低铅组和高铅组分别给予0．06%、0．20%醋酸铅水溶液自由饮用,对照组给予蒸馏水。用Y型迷宫测试学习记忆功能,采用石墨炉原子吸收光谱法测定血铅和脑铅,mRNA原位杂交法测定Hoxa9基因表达,用HE染色法进行病理学检查。结果(1)随着染毒时间的延长,低铅组和高铅组大鼠学习错误次数明显增加,对照组增加不明显。低铅组和高铅组大鼠学习错误次数明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0．01)；至实验结束时大鼠的学习错误次数低铅组为31．8±2．26,高铅组为37．3±1．70,对照组为18．4±1．51。(2)低铅组和高铅组大鼠脑组织显著萎缩,细胞凋亡、坏死明显,小脑浦肯野氏细胞脱失明显。对照组脑组织无萎缩,细胞凋亡、坏死不明显。(3)低铅组和高铅组Hoxa9 mRNA表达率明显低于对照组。结论铅可影响Hoxa9基因表达进而诱导细胞凋亡、坏死,损害学习记忆功能。

携带同源盒基因HOXA9的逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带同源盒基因(homeobox gene)HOXA9的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法 PCR扩增HOXA9基因编码区全长序列克隆至逆转录病毒载体MSCVneo,经酶切、测序鉴定。将重组载体脂质体转染包装细胞系PT67,以G418筛选稳定产毒细胞株。收集病毒悬液并测定病毒滴度。结果重组逆转录病毒载体MSCVneo经酶切、测序鉴定正确。将筛选所得的高效产毒细胞株命名为PT67/MSCVneo-HOXA9,测定病毒滴度为5×105CFU/ml。结论成功构建了携带HOXA9基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、准确产生逆转录病毒的细胞株。

HOXB4、PRDM16及HOXA9在急性髓系白血病中的表达及临床意义

目的:检测HOXB4、PRDM16及HOXA9在急性髓系白血病(AML)患者骨髓中的表达水平,探讨其临床意义。方法:采用实时荧光定量PCR方法,检测40例初治或复发AML患者、9例完全缓解患者和19例对照者(非恶性血液病患者及健康供者)骨髓细胞HOXB4、PRDM16及HOXA9 mRNA表达水平,分析其与疾病特征、临床疗效之间关系。结果:初治或复发AML患者骨髓细胞中HOXB4、PRDM16和HOXA9表达水平均明显高于非恶性血液病患者(P<0.05);初治或复发AML患者HOXB4基因表达水平与骨髓白血病细胞比例成正相关(r=0.39),HOXB4、PRDM16和HOXA9基因的表达水平两两之间具有相关性;AML不同病程阶段(初诊、复发、缓解)HOXB4、PRDM16基因表达水平差异具有统计学意义;按预后危险度分层将初治及复发AML患者分为高、中、低危3组,3组之间HOXB4、PRDM16、HOXA9表达水平的差异无统计学意义;经2个疗程正规化疗,缓解组(CR/PR)患者治疗前的3个基因表达水平均低于未缓解组治疗前水平(P<0.05);上述3个基因低表达组缓解率均高于高表达组(P<0.05)。结论:HOXB4、PRDM16、HOXA9基因表达水平与AML患者肿瘤负荷、疗效和预后存在一定的关系。在初治和复发的AML患者骨髓细胞高表达,缓解后其表达水平下降,表达高者化疗效果差,缓解率低。

HOXA9在髓系白血病细胞HL-60中的表达及药物对其干预作用

本研究旨在观察同源盒基因(HOX)HOXA9在髓系白血病细胞HL-60中的表达和药物干预对其表达的影响,在mRNA水平和蛋白水平探讨HOX介导白血病的发病机制。用实时荧光定量PCR法观察HOXA9 mRNA的表达,Western blot法观察HOXA9蛋白的表达,以及全反式维甲酸(ATRA 1μmol/L)或三氧化二砷(As2O3 1μmol/L)对HOXA9表达的调节作用。结果表明:ATRA组和As2O3组的HOXA9基因表达都呈先上升后下降趋势,第1天就有表达,在第2天表达上升,而在第3天表达降低。ATRA组和As2O3组的HOXA9蛋白第1天就有表达,对照组与ATRA处理组HOXA9蛋白表达呈先上升后下降趋势;As2O3处理组HOXA9蛋白表达呈逐渐下降趋势。ATRA组HOXA9基因的表达在第1-3天均较对照组高(P<0.05);As2O3组HOXA9基因表达水平与对照组比较,第2天增高(P<0.05),第1,3天差异无统计学意义。ATRA组HOXA9蛋白的表达水平在第1-3天均较对照组高(P<0.05);As2O3组HOXA9蛋白表达量与对照组比较,第1天增高(P<0.05),第2天降低(P<0.05),第3天变化无统计学差异。结论:HOXA9在人髓系白血病细胞HL-60中有表达,1μmol/L ATRA能上调HL-60细胞中HOXA9mRNA和蛋白的表达,ATRA、As2O3治疗白血病的机制可能与调节HOXA9 mRNA和蛋白的表达有关。

同源盒基因HOXA9在儿童急性白血病中的表达及其临床意义

目的研究同源盒基因HOXA9在儿童急性白血病(AL)患儿骨髓单个核细胞中的表达,并探讨其临床意义。方法采用RT-PCR方法检测46例不同时期AL患儿HOXA9 mRNA的表达水平,以15例特发性血小板减少性紫癜(ITP)患儿作为对照。结果 46例AL患儿(52份骨髓标本)HOXA9基因阳性表达率为63%,其中急性髓细胞白血病(AML)组阳性表达率(86%)明显高于急性淋巴细胞白血病(ALL)组(35%)及对照组(13%)(P<0.05);AML组HOXA9 mRNA表达水平明显高于ALL组及对照组(P<0.05)。HOXA9在各型儿童AML中表达不同,mRNA相对表达水平依次为:M5型>M4型>M1和(或)M2型,而在M3型中未检测到表达。HOXA9在AML患儿高危组中的阳性表达水平较高。AML患儿初治组HOXA9基因阳性表达率及mRNA水平明显高于缓解组和对照组(P<0.05),而缓解组与对照组比较差异无统计学意义;未缓解组HOXA9基因表达显著高于缓解组和对照组(P<0.05)。结论 HOXA9基因高表达与AL的发生相关;AML患儿HOXA9基因表达水平明显高于ALL患儿。HOXA9基因高表达者与白血病危险程度有关,且提示预后不良。因此,HOXA9基因有望成为儿童AL诊断、治疗及判断预后的一个靶点。

Hoxa9和Shh在神经干细胞定向分化过程中的作用研究

目的:了解神经干细胞诱导分化所得胆碱能神经元和运动神经元中Hoxa9基因与音猬因子(Shh)的差异表达情况,探讨它们在神经干细胞定向分化过程中的作用。方法:采用实时定量PCR技术,观察Hoxa9基因与音猬因子在胆碱能神经元和运动神经元中的表达情况。结果:Hoxa9在胆碱能神经元中的表达是在运动神经元中的0.169倍(P<0.05)。Shh只在运动神经元中有表达。结论:Hoxa9与Shh在运动神经元和胆碱能神经元之间的表达差异是由于分化时段的不同所导致的。二者在神经干细胞向运动神经元的分化过程中都起着重要的作用。

一例伴t(7;11)(p15;p15)和t(5;12)(q33;p13)染色体易位髓系肿瘤患者的分子遗传学研究

目的了解同时伴有t(7;11)(p15;p15)和t(5;12)(q33;p13)罕见染色体易位的髓系肿瘤患者的临床和分子遗传学。方法收集患者的临床表现、实验室特征及诊治经过;用RT-PCR方法扩增融合基因,通过高通量DNA测序联合基因组DNA-PCR技术检测51种髓系基因突变。结果患者表现主要为皮疹、纳差、乏力及脾肿大;外周血白细胞明显升高,骨髓形态学显示FAB-M2亚型;经RT- PCR证实NUP98/HOXA9和ETV6/PDGFRB融合基因均阳性,二代测序显示WT1 p.C423Y、KRAS p.G12D及DNMT3A p.R882C三种突变共存。传统IAC方案化疗联合伊马替尼治疗后达形态学缓解,但1个月后复发,HAA方案再诱导化疗无效。病程中持续检测NUP98/HOXA9及EV6/PDGFRB转录本水平,提示EV6/PDGFRB在治疗后迅速达到分子学改善,而NUP98/HOXA9则表现为稳定高表达。结论同时伴有t(7;11)(p15;p15)和t(5;12)(q33;p13)易位的AML具有独特的临床及分子遗传学特征,加用伊马替尼不能改善其不良的预后。