猪传染性胃肠炎病毒TH-98株HP基因的克隆与序列分析

hp基因位于猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因组的3′端,该基因在病毒复制时表达编码一个78AA、9100的疏水蛋白。该蛋白可以与猪超免抗TGEV血清发生免疫沉淀反应。目前,对其功能的研究还不是十分清楚。但就其在细胞内的位置而言,hp蛋白可能对复制复合体膜的缔合以及病毒粒子的装配起重要作用。根据Genebank已发表的TGEVhp基因cDNA序列,利用Oligo4.1软件设计一对引物,进行RT-PCR扩增hp基因。将PCR产物用KpnI和XbaI酶切后克隆到载体pPROEXHTc的KpnI和XbaI多克隆位点上。然后对重组质粒进行相应的酶切鉴定和PCR鉴定。将重组子测序并且与其国外分离株进行同源性比较。结果表明,hp基因克隆成功是可信的。本研究为进一步研究TGEV的基因组及其非结构蛋白奠定了重要基础。

鸡柔嫩艾美耳球虫HP基因的真核表达及其对鸡巨噬细胞凋亡的影响

HP基因编码蛋白是本实验室近期发现的一种鸡柔嫩艾美耳球虫的外分泌蛋白。本试验旨在构建重组荧光真核表达质粒pEGFP-HP,将其转染至细胞内,以此来分析HP基因对宿主细胞凋亡的影响。以柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子cDNA为模板进行PCR扩增,然后克隆至荧光真核表达质粒pEGFP,构建重组荧光真核表达质粒pEGFP-HP,将其转染至鸡巨噬细胞(HD11),42 h后采用流式细胞术检测宿主细胞凋亡情况。菌液PCR鉴定和测序鉴定结果显示,重组荧光真核表达载体pEGFP-HP构建成功。流式细胞术检测发现,pEGFP-HP重组质粒组的早期凋亡率显著高于pEGFP空质粒组和空白对照组(P<0.01)。结果表明柔嫩艾美耳球虫HP基因会促进HD11的细胞凋亡,尤其是早期细胞凋亡。本试验为进一步研究HP基因的生物学功能及其作用机制提供了依据,且将HP基因从此命名为柔嫩艾美耳球虫凋亡诱导基因(IA)。

小麦HP基因家族鉴定和分析

组氨酸磷酸转运蛋白HP(histidine phosphotransfer proteins)在植物的生长发育调控及逆境胁迫应答中发挥重要作用。为理解HP基因在小麦基因组中的进化特征和功能,研究通过生物信息学分析鉴定普通小麦的HP基因家族成员,对其理化性质、进化特征、基因结构、顺式作用元件以及在逆境胁迫条件下的表达模式进行了分析。结果表明,在小麦基因组鉴定到31个HP基因,编码蛋白质序列包括116~200个氨基酸。通过和其他植物的HP蛋白比较以及对蛋白结构、基因结构和基序的分析,显示小麦HP家族基因序列具有保守性。顺式作用元件预测表明,HP基因具有光、植物激素、干旱、低温等非生物胁迫响应相关的启动子调控元件。热图分析表明,HP基因在应答非生物胁迫中表达模式存在多样性;qRT-PCR分析表明,TaHP5-6B基因在低磷胁迫下受到强烈的诱导表达。综上所述,小麦全基因组鉴定的HP家族基因是非生物胁迫响应的重要基因资源。

中国南方荷斯坦牛HP基因多态性与产奶性状及血液生理生化指标的关联分析

试验旨在研究中国南方荷斯坦牛触珠蛋白(Haptoglobin,HP)基因的多态性及其对产奶性状、血液生理生化指标的影响。利用直接测序法及SNaPshot技术检测HP基因编码区(Coding sequence,CDS)的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,并对这些多态性位点不同基因型和组合与785头中国南方荷斯坦牛的产奶性状及血液生理生化指标进行关联分析。结果显示,HP基因的CDS区域存在3个SNPs位点,即rs41871650、rs209034260和rs41871651,这3个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。在试验群体中,rs41871650位点对305 d奶量、总奶量和高峰奶性状的效应达到显著水平(P<0.05);rs209034260位点对总奶量和高峰奶性状的效应达到显著水平(P<0.05)。rs41871650位点对天门冬氨酸转氨酶(AST)影响极显著(P<0.01),对淋巴细胞百分比(LYMPH%)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)及碱性磷酸酶(ALP)影响显著(P<0.05);rs41871651位点对LYMPH%和AST影响极显著(P<0.01),对红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)和甘油三酯(TG)影响显著(P<0.05)。HP基因rs41871650及rs209034260位点的优势基因型组合GG-CC和GG-TT个体305 d产奶量和高峰奶显著高于GA-CT组合个体(P<0.05),AST极显著低于AA-TT和GA-TT组合个体(P<0.01),ALP显著低于AA-TT组合个体(P<0.05)。说明HP基因可以作为影响中国荷斯坦牛产奶性状和健康性状的候选基因用于标记辅助选择。

不同hp基因类型番茄中番茄红素与主要品质性状的差异及相关分析

以3种含高色素hp基因类型的7个突变体番茄为试材,采用随机区组设计,研究了不同hp番茄果实中番茄红素含量差异及与其它主要品质指标的相关性,以期为番茄果实中番茄红素性状的改良提供优良的基因供体和理论依据。结果表明:不同hp突变体番茄果实中番茄红素含量存在显著和极显著差异,总体趋势表现为hp2>hp1>hp3>对照(非hp基因突变体),其番茄红素含量平均值依次为153.3、123.8、110.3、103.0mg/kg;相关分析表明,不同hp基因突变体番茄果实中番茄红素含量与可溶性蛋白质含量、维生素C含量、可溶性总糖含量和糖酸比的相关性均未达到显著水平,但具有一定的正向相关性,即糖酸比>维生素C含量>可溶性蛋白质含量=可溶性总糖含量。

基于幽门螺杆菌hp0169基因三维结构的生物信息学分析

目的:克隆幽门螺杆菌(Hp) hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构。方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性。原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni^(2+)亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件。结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300。HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白。HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为6.87%,无规则卷曲为38.63%。抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的5个优势线性表位和3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位。同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕。HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在0.2 mol·L^(-1)氯化镁、 0.1 mol·L^(-1)三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L^(-1)己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体。结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础。

幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析

目的获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410。方法提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析。将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。结果生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白。结论HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗。

幽门螺杆菌hp1188基因的原核表达及免疫学鉴定

目的:构建高效表达Hp1188重组蛋白的基因工程菌pQE30-hp1188-DH5α,提纯重组蛋白,鉴定其抗原性和免疫原性。通过小鼠灌胃试验,验证Hp1188蛋白阻止幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)在胃内定植的作用。方法:构建重组质粒pQE30-hp1188,DNA测序分析正确后,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化,SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度,Western blot鉴定对相应抗原的特异性,双向琼脂扩散实验检测效价。纯化重组蛋白和粘膜佐剂霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin subunit B,CTB)的混合液灌胃免疫接种预防组BALB/c小鼠,同时设阴性对照组和阳性对照组,免疫4周后用H.pylori NCTC 11637攻击3次,末次攻击4周后处死小鼠,进行胃组织H.pylori培养;H.pylori定植半定量、炎症程度及其炎症活动度的评分,以评价重组蛋白对胃组织H.pylori感染的免疫保护作用。结果:构建的重组表达质粒pQE30-hp1188经DNA测序证实序列完整,插入的基因片段全长810bp,与基因文库中的hp1188基因同源性达98%,并在大肠杆菌DH5α中表达出分子量约为30kD大小的可溶性目的蛋白,表达量占全菌总量的47%,表达蛋白纯化后纯度达90%,浓度为1.0mg/ml。Western blot证实有良好抗原结合特异性,双向琼脂扩散效价为1∶16。预防组H.pylori感染率、定植及炎症程度评分均明显低于阳性对照组(P<0.05)。预防组不仅可以降低H.pylori的定植,而且能减轻H.pylori造成的小鼠胃组织的局部慢性炎症反应。结论:成功构建了基因工程菌pQE30-hp1188-DH5α,并高效表达了Hp1188重组蛋白,表达蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,在小鼠体内能阻止H.pylori的定植。

幽门螺杆菌hp0529基因缺陷株的构建及其功能初步研究

目的:构建幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统hp0529基因缺陷株,并对其功能进行初步探讨。方法:采用同源重组原理,PCR技术扩增hp0529基因编码区两侧序列同源臂,构建含卡那霉素抗性标志的自杀质粒p Blue KM40-△hp0529;利用电穿孔法将其导入受体野生株中,通过卡那霉素筛选出hp0529基因缺陷株并经PCR及酶切方法鉴定;分别对缺陷株和野生株进行培养,观察其生长状况;并将两株细菌分别与胃上皮GES-1细胞共培养,检测hp0529基因缺陷株诱导GES-1细胞IL-8 mRNA水平的变化。结果:成功构建出幽门螺杆菌hp0529基因缺陷株;该基因敲除对细菌生长无明显影响,但对诱导GES-1细胞IL-8 mRNA表达有明显抑制作用。结论:成功构建hp0529基因缺陷株,该基因对细菌生长无明显影响,但能影响GES-1细胞IL-8 mRNA的表达。

幽门螺杆菌hp1188基因的原核表达

目的:重组表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究该基因所编码蛋白在H.pylori的黏附过程中的作用奠定基础。方法:以H.pylori标准株NCTC11637基因组DNA为模板,PCR扩增hp1188基因片段,克隆至质粒pQE-30中获得重组质粒pQE30-hp1188,经DNA测序确认后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测表达,Westernblot鉴定相应抗原表位。结果:扩增的hp1188基因片段全长810bp,与基因文库中的hp1188基因同源性达98%。SDS-PAGE显示表达产物相对分子量约为30600Dalton,与预期相符;大肠杆菌裂解液中表达产物接近可溶性蛋白总量的一半,但沉淀中仍能检测到表达蛋白。目标蛋白纯化后均一性接近90%,Westernblot证实与多克隆抗体有良好结合能力。结论:成功克隆了hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。

胃癌合并Hp感染患者Hp血清抗体基因分型测定及其意义

目的 了解本地区胃癌患者幽门螺杆菌(Hp)血清抗体基因分型情况及胃癌发生与Hp血清抗体基因分型的可能影响因素。结果 Ⅰ型幽门螺杆菌在胃癌中所占比例较Ⅱ型更高,差异有统计学意义(χ2=15.2,P<0.05);非萎缩性胃炎组Ⅰ型所占比例小于Ⅱ型,差异有统计学意义;胃癌患者幽门螺杆菌抗体基因分型I型与Ⅱ型与性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05),幽门螺杆菌抗体基因分型I型与吸烟史、饮酒史及胃癌家族史有一定相关性。结论 幽门螺杆菌抗体基因分型在胃癌及非萎缩性胃炎中有差异,其检测结果可指导并助力临床抗幽门螺杆菌精准及个体化治疗。

结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。

幽门螺杆菌hp0596基因缺失突变体的构建

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp0596基因缺失突变体,为进行hp0596基因功能研究奠定基础.方法:利用PCR技术,从H.pylori 26695基因组分别扩增得到hp0596基因的上游同源臂和下游同源臂,与两端带有FRT位点的氯霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化入H.pylori 26695;在抗生素选择压力下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过氯霉素抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌.结果:构建的突变载体经限制性内切酶酶切分析显示,产生的条带与预计结果完全一致.PCR方法扩增突变株0596,cmr基因显示,0596基因已经被完全敲除,经DNA测序,RNA水平,蛋白质水平证实筛选得到了0596基因缺失的H.pylori26695△0596突变株.连续培养7代后,H.pylori26695△0596突变株具有良好的稳定性.结论:获得了H.pylori26695△0596基因缺失突变体.

重组质粒pcEgr-hp53的构建及在A549和SKOV-3细胞中电离辐射诱导p53基因和蛋白的表达

目的构建重组质粒pcEgr-hp53,并探讨其在A549和SKOV-3细胞中的辐射诱导表达及抗癌作用。方法将野生型p53 cDNA全长插入pcDNA3.1质粒多克隆位点,用Egr-1启动子替代pcDNA3.1质粒CMV启动子,构建成pcEgr-hp53重组质粒;通过脂质体介导转染法将重组质粒pcEgr-hp53和pcDNA3.1分别转染入A549和SKOV3细胞株,并经G418筛选稳定克隆并扩增培养。采用RT-PCR和流式细胞术的方法检测了不同剂量X-射线照射转染后的A549和SKOV-3细胞p53基因转录水平和蛋白表达的变化。结果经限制性内切酶酶切鉴定,辐射诱导表达载体pcEgr-hp53构建正确。与0 Gy比较,A549-hp53和SKOV-3-hp53经0.5-5 Gy照射后,p53 mRNA水平增高;A549-hp53在2-5 Gy后,p53蛋白表达显著增高(P<0.01),SKOV-3-hp53其蛋白表达随剂量(0.5-5 Gy)增加而明显增加(P<0.05-P<0.01)。A549-hp53与A549-vect相同照射剂量组比较,其p53蛋白表达在0.5 Gy照射后明显下降(P<0.05),2-5 Gy照射后明显增高(P<0.01);SKOV-3-hp53与SKOV-3-vect相同照射剂量组比较,其蛋白表达在0 Gy时增高,0.5-5 Gy照射后明显增高(P<0.01)。结论X-射线可激活早期反应生长因子Egr-1,无论肿瘤细胞p53基因状态如何,均可诱导其下游基因p53 mRNA及其p53蛋白表达增强。

番茄hp1和dg基因高效检测体系的建立

根据NCBI中提供的番茄红素单碱基突变基因hp1和dg的序列,设计特异性引物。利用同一PCR反应体系同时扩增筛选番茄红素基因hp1和dg,以及野生型基因HP1和DG。结果表明:扩增的特异性片段与单基因引物扩增片段完全吻合。SNP分子标记为单显性标记,突变基因纯合体只在突变材料PCR体系中产生298和870bp的特异性片段,野生基因纯合体只在野生材料PCR体系中产生298和870bp的特异性片段,杂合体在2个反应体系中均有特异性片段。利用该体系在F2代中筛选出同时含hp1和dg基因的纯合植株,大大节省了工作量,提高了准确度。

应用全外显子组测序技术鉴定1个白化病家系致病基因HPS1

目的采用全外显子组测序鉴定1个常染色体隐性遗传白化病家系患者的致病基因,探讨其发病机制。方法采集先证者及其家系成员外周血并提取其基因组DNA,对先证者进行全基因外显子组测序,并结合序列变异生物信息学分析方法,鉴定其致病基因,利用Sanger测序对基因突变位点验证。结果全外显子组测序结果显示,先证者HPS1基因存在由c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)移码突变和c.398+5G>A剪切位点变异组成的复合杂合突变,而其表型正常的父亲为c.1276_1279dupGGAG(p.Asp427fs)杂合突变,表型正常的母亲为c.398+5G>A杂合突变。结论该白化病先证者由HPS1基因c.1276_1279dupGGAG和c.398+5G>A复合杂合突变导致,此患者被诊断为Hermansky-Pudlak综合征1型。外显子测序技术可以快速准确地筛查白化病候选基因,并明确其具体临床亚型,有利于临床医师积极干预患者潜在并发症以及改善患者生存质量。

针对HP450基因shRNA真核表达载体的质粒转染

目的以pGPH1/GFP/Neo质粒为载体,构建特异性针对HP450基因shRNA真核表达载体,并通过脂质体介导转染正常的大鼠肝细胞株(BRL),以探讨靶向干扰HP450基因对BRL细胞生长的影响。方法构建pGPH1/GFP/NeoHP450真核表达载体。应用脂质体转染技术,将重组的pGPH1/GFP/Neo-HP450真核表达载体转染至大鼠肝细胞株(BRL),并于转染后6、12、24 h在荧光倒置显微镜下观察细胞状态。结果成功构建针对HP450基因shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,通过脂质体介导转染大鼠肝细胞株BRL,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞转染后的荧光现象。结论成功构建的HP450 shRNA真核表达载体pGPH1/GFP/Neo-HP450,可通过质粒转染方法转染至BRL细胞。

HP450基因的克隆及其重组载体pMD18-HP450的构建与鉴定

目的构建HP450基因的克隆载体。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体。以菌液为模板做PCR、酶切和测序鉴定pMD18-HP450重组质粒载体。结果菌液PCR扩增出目的条带、重组体的酶切产物合理,测序显示目的基因与基因库中的H1基因100%同源。结论实现了HP450基因的克隆及其重组质粒载体pMD18-HP450的构建。

HP450基因的克隆及质粒载体的构建和鉴定

目的HP450基因的克隆载体构建。方法用RT-PCR技术克隆HP450基因,T-A连接到PMD18-T载体,经菌液PCR,酶切鉴定.构建成PMD18-HP450重组质粒载体。结果测序显示完全正确,实现了HP450基因的克隆和质粒载体的构建。结论可以对重组成功的HP450基因进行体外表达和动物的体内应用.