HPA-1a抗体MAIPA定量检测标准体系的建立

目的建立针对人类血小板抗原HPA-1a抗体的血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定定量检测(MAIPA)的标准体系。方法用MAIPA方法检测不同稀释度的标准HPA-1a抗血清,优化该方法的最佳实验条件,绘制线性标准曲线,并对该方法的敏感度、特异性、准确度和精密度进行了分析。结果经优化,确定MAIPA定量检测方法的最佳实验条件如下:铺板抗体羊抗鼠Ig G单抗:3μg/m L,血小板每孔2×107个,检测抗体小鼠抗人CD61单抗:20μg/m L,酶标羊抗人Ig G:稀释度1:10 000。该方法的线性检测范围是0-4 IU。该方法最低检测限至少为0.3 IU,批内变异系数为1.3%-3.6%,批间变异系数为4.0%-5.6%。特异性检测:用抗-A、抗-B、抗-H、抗-I、抗-P1、抗-Lewisa等试剂以及含其他抗体的抗血清进行试验,均无明显阳性。结论本研究建立的针对HPA-1a抗体的MAIPA定量检测的标准方法具有较高的敏感度、特异性、准确度和精密度,对于临床相关疾病的诊断和血小板安全输注具有重要的应用价值。

已证实或可疑血小板同种免疫患者使用HPA-1a／5b阴性血小板浓缩物的临床有效性调查

新生儿同种免疫性血小板减少症（NAIT）是由于胎儿存在人类血小板抗原（HPA），母亲血小板未具此抗原，引发的同种免疫反应。最重要的不相合抗原是HPA—1a、HPA-5b，分别占引起NAIT的80％和15％。至今，还没有对NAIT的常规产前筛查，HPA分型、血小板特异抗体筛查、临床怀疑NAIT仅基于产后观察到新生儿紫癜或其他一些出血症状。实验室确认诊断NAIT需要几个小时，在一些病例中新生儿产后输注随机血小板有效，但在其余病例中无效，产后的适宜紧急处理是输注相合的血小板。

CHO-HPA-1a细胞快速检测人血小板同种(异型)抗体方法建立的分析

目的:探讨建立CHO-HPA-la细胞快速检测人血小板同种(异型)抗体方法,通过几种血小板抗体检测方法对比总结其临床诊断价值。方法:分别应用流式细胞术(FCM)、单克隆抗体特异性血小板抗原固定术(MAIPA)和应用蛋白印迹(WB)对新生儿血小板减少患儿母体进行基因分型和血清分型对比。结果:三种方法均检测到新生儿血小板减少患儿母体血清中的抗β-3抗体,但CHO-FCM方法敏感性与MAIPA接近,WB分析法敏感性最低。在血小板减少患儿疾病中,FCM检测阳性率达到91.3%,高于MAIPA的83.2%和WB分析法的73.8%。对比有统计学意义(P<0.05)。结论:当CHO细胞固定时,HPA-la抗原表面并未受损,且保存时间被明显延长,说明固定化细胞更适合于大量血小板减少患儿母体抗体的检测。CHO细胞模型可以成功地用来表达并研究HPA-1a的多态性及其抗原特性,同时可以作为用于临床检测抗HPA-1a同种(异型)抗体的一种替代方法。

Syndecan-1和HPA-1 mRNA在胃癌组织中的表达及其与胃癌侵袭转移的关系

背景与目的:Syndecan-1和HPA-1(乙酰肝素酶-1)可能参与多种恶性肿瘤的侵袭转移,但关于两者与胃癌的关系较少报道。本研究旨在探讨Syndecan-1mRNA和HPA-1mRNA在胃癌组织中的表达及两者与胃癌侵袭转移的关系。方法:采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测了58例胃癌及58例配对的癌旁组织(距癌2cm)和58例配对远离胃癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)Syndecan-1和HPA-1的mRNA的表达水平,分析探讨两者与胃癌临床病理特征和胃癌侵袭转移的关系。结果:HPA-1mRNA在胃癌中表达的阳性率(86.2%)显著高于癌旁组织(27.6%)和正常组织(5.2%)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P均<0.05)。Syndecan-1mRNA在正常组织中表达的阳性率(98.3%)显著高于癌旁组织(25.9%)和胃癌组(5.2%)(P均<0.001),癌旁组织中明显高于胃癌组织(P均<0.05)。Syndecan-1的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达与HPA-1mRNA的表达呈负相关。结论:Syndecan-1mRNA在正常胃组织中呈高表达,HPA-1mRNA在胃癌组织中呈高表达,且Syndecan-1的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进胃癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导胃癌临床治疗及判断预后有重要价值。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

用体外表达的血小板膜蛋白GPⅢa偶联Luminex微球检测HPA-1a抗体

目的拟利用体外克隆表达的GPⅢa蛋白作为HPA—1a抗原与LuminexxMAP微球相连，建立和评估用Luminex微球技术检测血清中抗HPA—1a的效果。方法扩增并克隆GPⅢa蛋白的编码基因ITGB3至真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢癌细胞株。利用G418筛选稳定表达细胞株，体外获取并鉴定相应的特异性膜糖蛋白GPⅢa。将重组蛋白通过表面游离氨基和Luminex xMAP微球表面激活的羧基相偶联，再利用偶联后的微球与待测血清反应。利用PE-抗人IgG进行显色，在Luminex-100仪上读取数据并判断结果。结果ITGB3基因测序为HPA-1aa，将克隆后的GPⅢa重组蛋白偶联Luminex xMAP微球，Luminex微球法检测HPA-1a抗体的灵敏度为滴度1／32（抗体浓度3．125U／mL）。微球技术能特异性鉴别出待测样本的HPA—1a抗体，与MAIPA结果一致，而且与HLA抗体、ABO抗体以及其他HPA血小板系统抗体（HPA-3a、HPA_5b）均不发生交叉反应，说明建用立的Luminex微球技术来检测血小板抗体是可行的。结论成功获取了重组表达的血小板膜蛋白GPⅢ3，并初步建立了Luminex微球检测HPA-1a抗体方法。

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结直肠癌中Tiam-1和HPA-1基因的表达

目的:检测Tiam-1基因和HPA-1基因在结直肠癌组织中的表达水平,探讨两者与结直肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:选取2009年8月-2010年1月我院行手术治疗的结直肠癌患者53例。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Tiam-1 mRNA及HPA-1 mRNA在结直肠癌组织、癌旁组织(距癌2cm)及远离结直肠癌的手术切缘正常组织中(距癌5cm以上)的表达水平,并分析两者与结直肠癌临床病理参数的关系。结果:HPA-1 mRNA和Tiam-1 mRNA在结直肠癌中的表达水平(35.87±12.30,40.79±9.32)显著高于癌旁组织(13.13±6.71,12.39±5.38)和正常组织(4.06±3.55,6.09±4.86,P均<0.05),癌旁组织中二者的表达水平高于正常组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Tiam-1和HPA-1的基因表达水平在肿瘤的高/中分化和低分化之间,T1～T2和T3～T4之间,有淋巴结转移和无淋巴结转移之间、有血行转移和无血行转移之间及Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ期之间的差异均有统计学意义(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Tiam-1与HPA-1的表达呈正相关趋势(OR=0.46,P=0.048)。结论:Tiam-1 mRNA和HPA-1 mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且二者的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移,联合检测Syndecan-1及HPA-1对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

肝癌中Tiam-1和HPA-1的表达及其与侵袭转移的关系

目的:探讨Tiam-1和HPA-1基因在肝癌中的定量表达及其与肝癌侵袭转移的关系。方法:选取2009年5月至2012年1月行手术治疗的肝癌患者65例。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Tiam-1 mRNA及HPA-1mRNA在原发性肝细胞肝癌、配对癌旁组织(距癌2 cm)及正常肝脏组织中(距癌>5 cm)的表达水平,并分析两者与肝癌临床病理参数的关系。结果:肝癌组织中Tiam-1 mRNA的表达水平(43.83±11.62)显著高于癌旁组织(14.82±8.16)和正常肝脏组织(6.02±5.36)(均P<0.05),癌旁组织中Tiam-1 mRNA的表达水平高于正常肝脏组织(P<0.05)。肝癌组织中HPA-1 mRNA的表达水平(35.28±11.81)显著高于癌旁组织(12.94±6.25)和正常肝脏组织(4.17±3.49)(均P<0.05),癌旁组织中HPA-1 mRNA的表达水平高于正常肝脏组织(P<0.05)。Tiam-1及HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、血行转移及TNM分期显著相关(均P<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Tiam-1和HPA-1的表达呈明显正相关(OR=0.523,P<0.05)。结论:Tiam-1mRNA和HPA-1 mRNA在肝癌组织中呈高表达,且两者的表达增强可促进肝癌的侵袭转移。联合检测Tiam-1及HPA-1对于指导肝癌临床治疗及判断预后有重要价值。

西藏藏族人群HPA-1～6、15多态性研究

目的研究西藏藏族人群中HPA-1～6、15的分布特征。方法采集西藏藏族无偿献血者标本405例,以PCR-SSP进行HPA-1～6、15基因分型。引物参照英国生物标准与质控研究院及Feng LM等文献合成。方法可靠性以国际血小板免疫学研讨会参比DNA验证,并选择部分标本以PCR-SBT复核。基因频率以计数法计算;以SPSS17.0检验Hardy-Weinberg平衡;以PEMS3.1进行χ2检验。结果PCR-SSP结果与参比DNA和PCR-SBT分型结果均一致。405名藏族献血者HPA各等位基因的频率分别为:HPA-1a:0.9383,HPA-1b:0.0617;HPA-2a:0.9716,HPA-2b:0.0284;HPA-3a:0.6173,HPA-3b:0.3827;

青岛地区汉族人群HPA-1—5,15多态性分布研究

目的研究青岛地区汉族人群人类血小板抗原(HPA)1-5,15抗原分布多态性。方法采用PCR-SSP方法对青岛地区918名无血缘关系固定血小板无偿捐献者进行HPA1-5及HPA-15系统的基因分型.结果各被检系统等位基因频率分别是1a=0.9940,1b=0.0060,2a=0.9319,2b=0.0681,3a=0.5822,3b=0.4178,4a=0.9897,4b=0.0104,5a=0.9804,5b=0.0196,15a=0.4913,15b=0.5087;HPA基因频率分布与国内资料比较,HPA-1与北方人群(河南),HPA-2与南方人群(四川)差异有统计学意义;与台湾人群HPA-2,-4,与日本人群HPA-2,-3,-5,与美国黑人HPA-1,-2,-5,与白人HPA-1,-4,-5,-15分别有统计学显著性差异。结论青岛地区汉族人群HPA分布具有本地人群特点。本组HPA数据分布符合Hardy-Weinberg平衡定律,可以作为北方汉族人群HPA基因分布频率数据库和青岛本地化血小板供者HPA资料库。

原发性肝癌组织中LASP-1 mRNA和HPA-1 mRNA表达水平及其临床意义

目的定量检测LIM和SH3蛋白1(LASP-1)mRNA和乙酰肝素酶-1(HPA-1)mRNA在原发性肝癌组织中的表达水平,探讨二者与肝癌发生、侵袭和转移的关系。方法利用实时荧光定量PCR检测法分别检测62例原发性肝癌癌组织、配对癌旁组织(距癌2 cm)和正常肝脏组织(距癌大于5 cm)中LASP-1mRNA和HPA-1 mRNA的表达水平,并分析二者与肝癌临床病理特征的关系。结果肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中HPA-1 mRNA表达水平分别为47.25±16.65、23.15±14.89、7.56±5.15,LASP-1 mRNA的表达水平分别为51.66±20.12、35.73±15.07、10.17±8.29。HPA-1 mRNA及LASP-1 mRNA在癌组织中的表达高于癌旁组织和正常组织(P均<0.05)。HPA-1及LASP-1的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05,P<0.01),与患者年龄、性别及肿瘤大小无关(P均>0.05)。Spearman等级相关分析显示LASP-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达呈正相关(OR=0.421,P<0.05)。结论肝癌组织中LASP-1 mRNA与HPA-1 mRNA的表达与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移及TNM分期等密切相关。二者联合表达水平的增加可能促进肝癌的侵袭转移。

汉族人群人类血小板抗原-1系统a/b/x等位基因多态性调查

目的:调查HPA-1抗原系统a/b/x等位基因在汉族人群中的多态性分布。方法:利用聚合酶链反应-序列特异引物技术(PCR-SSP)技术对1000例中国无关健康汉族人群样本进行HPA-1抗原系统等位基因分型,随机抽取部分样本进行测序验证。结果:本次调查共检测到HPA-1a/a基因型988个,HPA-1a/b基因型12个,未检测到HPA-1x等位基因。结论:HPA-1抗原系统在中国汉族人群中以HPA-1a等位基因为主(99.4%),HPA-1b分布频率较低(0.6%)。目前国内尚未发现HPA-1x等位基因,有必要进一步扩大样本对不同地区、不同民族进行多态性调查。