敲减人HPIP基因表达抑制细胞生长增殖

为了探讨人造血相关的PBX相互作用蛋白质基因(HPIP)在肿瘤发生发展中的生物学作用,构建了HPIP小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,验证其敲减效果并观察其对细胞生长增殖的影响.根据人HPIP的cDNA序列,设计了含有小发卡结构的寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过实时定量RT-PCR及Western印迹分析检测HPIP基因的表达水平;结晶紫实验及流式细胞技术检测敲减HPIP基因表达对细胞生长和增殖的影响,软琼脂实验检测对肿瘤细胞非锚定依赖性生长的影响.结果显示,构建的siRNA能够有效抑制HPIP基因的表达;结晶紫实验与细胞周期分析实验显示,siRNA介导的HPIP表达沉默导致细胞生长增殖的显著抑制,软琼脂实验结果表明,稳定转染HPIP siRNA能够抑制肿瘤细胞的锚定非依赖性生长.上述结果初步表明,HPIP siRNA能明显抑制肿瘤细胞的生长与增殖,可能是一个潜在的肿瘤治疗新靶点.

HPIP基因siRNA对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转化及凋亡的影响

目的:探讨抑制HPIP基因表达对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及凋亡的影响。方法:10ng/mL的TGF-β1刺激HK-2细胞24,48h,Western印迹法检测HPIP蛋白表达。将HK-2细胞随机分为空白组、TGF-β1组和TGF-β1+si-HPIP组,处理24 h后,Western印迹法检测HPIP,E-cadherin,α-SMA,N-cadherin,Snail,Twist,t-AKT,p-AKT和Ba x蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:TGF-β1刺激HK-2细胞24,48h后HPIP蛋白表达均显著高于对照组(0h)(P<0.05)。TGF-β1组E-cadherin蛋白表达显著低于空白组,α-SMA,N-cadherin,Snail,Twist,p-AKT和Bax蛋白表达及细胞凋亡率均显著高于空白组(P<0.05),而TGF-β1+si-HPIP组E-cadherin蛋白表达显著高于TGF-β1组,α-SMA,N-cadherin,Snail, Tw i st, p-A KT和Ba x蛋白表达及细胞凋亡率均显著低于TG F-β1组(P <0. 0 5)。结论:抑制HPIP基因表达可延缓肾小管上皮细胞EMT进程和降低细胞凋亡率,机制可能与下调PI3K/AKT信号有关。

人HPIP基因真核表达载体的构建及其对肺癌细胞的生物学影响

背景人造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白(hematopoietic pre-B cell leukemia transcription factor interacting protein,HPIP)参与多种肿瘤的发生发展过程,其在肺癌中的机制仍有待研究。目的构建带有Flag标签的HPIP真核表达载体,表达pcDNA3.0-Flag-HPIP融合蛋白,检测其对肺癌细胞增殖、迁移等生物学功能的影响。方法利用人乳腺文库作为模板,PCR技术扩增HPIP基因的编码序列,将其酶切产物连接到pcDNA3.0-Flag载体并测序。将重组质粒转染至A549肺癌细胞系中,Western blot验证转染后HPIP的蛋白表达情况。采用克隆形成实验、CCK-8法及细胞划痕实验等明确其对肺癌细胞增殖、迁移等功能的影响。结果PCR扩增得长度为2109 bp的HPIP基因编码序列,并成功插入至pcDNA3.0-Flag载体中。测序和Western blot验证融合蛋白构建成功。CCK-8法和克隆形成实验表明,与对照组相比,转染Flag-HPIP后肺癌A549细胞增殖能力显著增强。划痕实验证实转染Flag-HPIP后可明显提高肺癌A549细胞的迁移能力。结论本实验成功构建了带有Flag标签的HPIP基因真核表达载体,并证实其能够促进肺癌细胞的增殖和迁移,为后续HPIP在肺癌中的功能研究奠定了良好基础。