HPT-mCherry融合标签在水稻转基因筛选鉴定中的应用

目的:利用HPT-mCherry融合标签加速转基因筛选过程。方法:构建HPT-mCherry融合表达载体,采用农杆菌介导的转基因技术获得转基因植株,并利用荧光显微镜观察转基因愈伤和植株。结果:HPT-mCherry融合标签可用于转基因愈伤的筛选和转基因植株的鉴定;HPT与mCherry融合后互不影响,一方面可利用潮霉素抗性筛选愈伤,另一方面能通过观察mCherry红色荧光蛋白进行鉴定。结论:利用HPT-mCherry融合标签可以快速有效地鉴定并得到转基因阳性植株。

山梨酸钾辅助HPTS对芽孢的杀菌动力学及应用研究

本文研究山梨酸钾辅助高压热杀菌(HPTS)对枯草杆菌芽孢的灭活动力学。选用一级动力学模型、Weibull和Loglogistic动力学模型对山梨酸钾辅助HPTS对枯草杆菌芽孢的失活曲线进行动力学模型拟合。分析精确因子(A_(f))、偏差因子(B_(f))、均方根误差(RMSE)、决定系数(R^(2)),在3个模型中,山梨酸钾辅助HPTS的杀菌作用更符合Log-logistic动力学模型(R^(2)=0.986)。山梨酸钾(0.2 g/100 mL)辅助HPTS(600 MPa、75℃、25 min)时,失活效果最佳,芽孢致死率为6.10 lg(CFU/mL)。山梨酸钾辅助HPTS处理能有效杀灭甜瓜汁中的芽孢,且杀菌后甜瓜汁的褐变度显著降低,贮藏28 d后山梨酸钾(0.1 g/100 mL)辅助HPTS(600 MPa、75℃、25 min)处理的甜瓜汁在420 mn处的吸光度达0.093,而HPTS处理的对照样品的吸光度为0.058。通过扫描电镜观察甜瓜汁中枯草杆菌芽孢处理前、后的微观结构,处理后的芽孢形态结构发生变化。结论:山梨酸钾辅助HPTS具有显著的应用价值。

HPTS结合蛋清溶菌酶对枯草杆菌芽孢的灭活作用

本文研究了高压热杀菌技术(HPTS)结合蛋清溶菌酶处理对枯草杆菌芽孢的杀灭作用。采用HPTS(200 MPa-25,65,75℃)结合蛋清溶菌酶(0.05%,0.1%,0.3%)保压处理20 min,处理后测定枯草杆菌芽孢的失活量、蛋白质与核酸的泄漏量、电导率、细胞膜Na^(+)/K^(+)-ATPase活性变化、芽孢的形态结构变化、蛋白质二级结构稳定性变化、内膜通透性变化。结果表明,HPTS结合溶菌酶对芽孢具有明显的协同杀灭作用,200 MPa/75℃结合0.3%溶菌酶处理后,芽孢存活浓度下降3.91 lg(CFU/mL)。HPTS结合溶菌酶处理后芽孢蛋白质、核酸泄漏量及上清液电导率都显著增加,Na^(+)/K^(+)-ATPase活性显著降低,芽孢蛋白质稳定性下降,芽孢表面显示出极度的粗糙,伴随着严重的塌陷皲裂,结构发生了明显变化。流式细胞术分析发现,芽孢内膜的通透性显著增加。结论:HPTS结合蛋清溶菌酶处理抑制了芽孢代谢途径中关键酶的活性,同时破坏了枯草杆菌芽孢的芽孢壁、内膜等结构,改变了芽孢的生理特性,最终导致芽孢失活。

HPT工艺参数对Al-Zn-Mg-Cu合金强韧化机理研究

针对A1-Zn-Mg-Cu合金进行了HPT变参数正交实验,以探讨HPT工艺参数对合金力学性能的影响。通过多角度力学性能测试,包括抗拉强度和延伸率等,与常温试件的力学性能进行了比对,分析了变化规律;利用SEM对A1-Zn-Mg-Cu合金在高温下的断口形态进行观察,以揭示高温高压下A1-Zn-Mg-Cu合金的破坏机制。研究内容将为该技术在工业上的推广与应用奠定一定的理论与技术基础。

HPT对重度脊柱侧弯患者的治疗效果及负面影响

各种原因导致的重度脊柱侧弯畸形是一类严重的脊柱疾病,研究表明如果直接矫形手术,治疗难度大、风险高、围手术期并发症多。而术前是否需要辅助牵引及施行何种牵引尚存在争议。本文通过查阅国内外最新研究成果,就术前头盆环牵引(Halo-pelvic traction,HPT)辅助治疗重度脊柱侧弯的疗效及对患者神经、生理、心理等方面的负面影响进行综述。文献复习结果表明,术前辅助行HPT可有效减少重度脊柱畸形的Cobb角,并明显改善肺功能,增加术中矫形效果,减轻手术难度和风险。但牵引过程中也会导致患者生活质量下降,可能发生神经并发症等负面影响。其他牵引方式,如头颅-股骨牵引(Halo-femoral traction,HFT),其装置固定、患者无法移动行走,长时间牵引增加卧床的并发症发生率;头颅-重力牵引(Halo-gravity traction,HGT)最明显的缺点则是牵引力量有限(患者自身重量牵引),牵引效率低。提示术前HPT是一种安全有效的治疗重度脊柱侧弯的辅助手段。

转mCherry基因水稻的遗传分析及T-DNA整合位点的研究

为了建立转基因水稻的高通量遗传分析系统,本研究以粳稻成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料,潮霉素磷酸转移酶(HPT)为抗性筛选标记,通过农杆菌介导的方法将红色荧光蛋白基因mCherry导入水稻。在水稻转化愈伤组织、转化植株(T0)和转基因后代(T1)均检测到红色荧光,证实mCherry在转基因水稻中稳定表达。139个独立转化株系的遗传分析表明,mCherry在转基因后代表现多种遗传模式,54%的转基因株系呈单位点遗传。TAIL-PCR进一步验证转基因整合到水稻基因组。根据T-DNA整合位点DNA序列分析结果,T-DNA左边界发生碱基缺失、增加和替换,右边界只发生碱基缺失,说明左边界比右边界有更多的碱基变异类型。此外,对T2代植株mCherry和HPT的转录水平进行实时定量逆转录PCR分析,结果表明,mCherry和HPT转录水平因T-DNA在水稻基因组中的整合位置而变化,表现位置效应。本研究在mCherry荧光蛋白和其它相关方法的基础上,为转基因水稻遗传及分子分析建立了一个高效的流程体系。

转sck基因水稻中标记基因表达蛋白HPT食用安全性的初步研究

目的针对抗虫转sck基因水稻中标记基因表达蛋白HPT的食用安全性开展初步研究,主要包括该蛋白在大米中的定性、定量研究、可能的膳食摄入量估计及其潜在致敏性评估等.方法将HPT的编码序列插入带有组氨酸标签(His-tag)的原核表达载体PBV222中进行融合表达,通过脲变性和镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白.用纯化后的6His-HPT蛋白免疫家兔和小鼠,分别制备相应的抗HPT多克隆和单克隆抗体,进一步将这两种抗体组成双抗夹心酶联免疫检测体系,用于检测HPT在转sck基因水稻中的表达水平.在致敏性评估方面,首先将HPT序列与已知的致敏原数据库进行比较,再利用模拟的胃肠液环境进行体外消化稳定性实验.结果重组体经表达纯化后获得了高纯度(95%)的6His-HPT融合蛋白,免疫动物后获得了高效价的抗HPT多克隆及单克隆抗体,经免疫印迹检测证明所制备的抗体可与转基因水稻中及纯化出的HPT蛋白形成特异结合带.由这两种抗体组成的双抗夹心酶联免疫检测体系用于检测HPT抗原时的灵敏度为30ng/ml,可检测出转sck基因水稻叶片中HPT蛋白的表达量约为80～150ng/ml;而在相应的转基因大米中未能检出.HPT序列经与已知的致敏原数据库进行比较未见同源性,但在体外消化稳定性实验中,HPT蛋白在模拟的胃肠液环境中均迅速降解.结论就目前的检测水平来看,转sck基因大米中所含的HPT蛋白水平极低,且对消化环境不稳定,推测该标记基因表达蛋白不易引起可观察到的食用安全性问题.但利用表达的HPT蛋白直接进行动物急性毒性及致敏性实验的工作仍有待进行,有关的结果将进一步报道.

转基因水稻中标记基因hpt表达行为的研究

目的探讨转sck基因水稻中标记基因hpt的表达行为。方法对经潮霉素抗性筛选的转基因水稻4个生长发育时期、不同组织的hpt基因进行PCR检测;提取4个生长发育时期PCR检测阳性植株的叶片总RNA,以hpt基因片断为探针进行Northernblot分析,并对不同生长时期的叶片和成熟期的茎部、根部、种子进行双夹心ELISA检测,以同种非转基因水稻M86相应时期的相应部位作阴性对照。结果转基因水稻不同生长时期、不同组织中均能扩出特异的hpt(832bp)片段;Northernblot结果显示,在4个生长发育时期的hpt基因在转录水平均有表达,但是表达水平较低,且不同生长发育时期之间无明显差别;ELISA检测结果显示HPT蛋白在4个生长时期的叶片和成熟期的茎部和根部均有表达,种子中HPT蛋白的含量不超过负对照,不能被检测。结论不同生长发育时期的叶片中hpt基因在转录水平和翻译水平表达均能稳定表达。成熟的种子中不含有可检测水平的HPT蛋白。

植物选择标记基因hpt在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定

为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价,建立一种简便、高效的体外微生物表达体系,以获得大量的HPT蛋白,将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上,在E.coli BL21中进行诱导表达,所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在,且与Glutathione Sephrose 4B纯化介质的结合率不高。后经优化诱导表达的各种条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,该蛋白具有明显的生物活性。经Glutathione Sephrose 4B亲和层析,所得蛋白纯度>95％。动物实验显示,融合蛋白还具有良好的免疫原性,免疫家兔后可诱导产生高滴度的抗体(>1:10000)。ELISA及Western blotting检测进一步证实了所获纯化蛋白及其抗体的特性。这为深入进行HPT蛋白的安全性评价打下了良好的基础。

hpt与bar基因作为水稻转基因筛选标记的比较研究

标记基因的选择是影响植物遗传转化和转基因后代筛选成败的关键因素。hpf与bar作为两种常用的水稻转化筛选标记被广泛应用于水稻的转化。为比较两者在实际应用中的效果,文章首先对比了在潮霉素和除草剂(Bialaphos)两种筛选剂下水稻遗传转化的情况。研究表明,hpf基因的转化筛选体系相对于bar基因在转化效率上提高近两倍,转化周期提前至少10d,且插入基因拷贝数更低。随后,文章分析了利用潮霉素浸种法在田间筛选转基因水稻的可行性,研究显示当潮霉素浓度大于167mg/L时,可以对以水稻品种kitaake为亲本的转基因材料进行有效筛选,达到常规除草剂的筛选效果。但与除草剂相比较,潮霉素的田间筛选成本却处于劣势。文章研究和讨论了hpt和bar基因在遗传转化和后代田间筛选中的优缺点,并提供了一种利用潮霉素浸种法筛选转基因后代阳性植株的手段,为将来在水稻转基因研究工作中根据实际需求选择合适的遗传转化、筛选体系提供参考。

利用DNA免疫法制备植物选择标记基因hpt表达蛋白抗体的研究

目的 :制备转基因作物中选择标记基因潮霉素B磷酸转移酶 (hygromycinBphosphotransferase,hpt)基因表达产物的多克隆抗体 ,并探讨影响核酸免疫效果的因素及相应机制。方法 :以hpt的cDNA全长插入真核表达载体 pCDNA3中 ,并经限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定。以纯化的重组质粒pCDNA3 HPT免疫BALB/c小鼠。用在E .coli中表达并纯化的 (His) 6 HPT进行ELISA ,检测免疫过程中小鼠血清抗体效价的增长状况 ,并用Westernblot检测抗血清的特异性。结果 :经 3次核酸免疫后 ,小鼠血清中未发现明显的抗HPT抗体。第 4次加强免疫时 ,将小鼠分为 3组 ,每组两只。第 1组改用去内毒素的质粒提取试剂盒提纯的重组质粒免疫 ,第2组用 (His) 6 HPT融合蛋白免疫 ,第 3组仍用原来提取的重组质粒免疫。结果发现 ,第 1组小鼠抗血清的效价有所上升 ,经ELISA检测达 1∶2 0 0 ;第 2组抗血清的滴度显著升高 ,达到 1∶2 0 0 0 ;而第 3组小鼠血清中仍未检测到明显的抗体。Westernblot证实 ,前两组抗血清均可与亲和层析纯化的GST HPT、(His) 6 HPT融合蛋白及其诱导表达的相应菌体总蛋白发生特异性结合。结论 :用DNA免疫法成功地制备了抗hpt基因表达产物的特异性抗体 ,但抗体效价不够理想。推测与hpt基因本身的性质及其在体内表达呈现的水?

柱花草nptII、hpt和bar基因优化转化体系的建立

以热研5号柱花草(Stylosanthes guianensis cv.Ryan No.5)为材料,系统地研究了不同选择标记基因NptII,hpt和bar的柱花草转化体系.研究发现柱花草最适合基因转化的外植体是幼苗下胚轴.最佳愈伤组织形成和愈伤组织分化培养基为M S+NAA 1.0m g/L+6B-A4.0m gL/+3%蔗糖,pH6.最适宜外植体生根培养基是MS+N AA0mg/L+3%蔗糖(pH6).Glufosinate选择压力为0.15m g/L,Kanam ycin选择压力为20mg/L,Hygrom ycin选择压力为15m g/L.在以上的优化转化系统中,柱花草幼苗下胚轴分别侵染带NptII,hpt和bar基因的农杆菌(GV 3101)后,可获得30%愈伤组织具有kanamycin抗性,5%愈伤组织具有Hygromycin抗性,50%的愈伤组织具有Glufosinate抗性.

基于mCherry荧光蛋白的植物基因过表达遗传转化系统的初步研究

过量表达是植物基因功能鉴定和农作物遗传改良的重要途径。为了提高转基因植株的研究效率,以m Cherry红色荧光蛋白为报告基因,构建了由玉米泛素启动子(P-Ubi)和豌豆T3A-poly A序列组成过量表达框的转基因载体。分别将4个水稻类受体激酶的编码序列插入表达框,通过农杆菌介导转化水稻品种泰粳394。转基因植株T1种子的m Cherry荧光检测结果表明,平均62.5%的T1株系呈3∶1分离。根据实时定量RT-PCR分析结果,过表达阳性植株的目的基因相对表达量显著高于阴性植株和未转化的泰粳394。运用该载体系统,能够进行转基因后代大规模筛选,获得目的基因过量表达的转基因株系,从而促进植物基因功能研究和转基因应用研究。

表面活性剂对HPTS荧光的单分子猝灭及胶束作用

研究了各种表面活性剂存在下,8-羟基-1,3,6-三磺酸芘钠盐(HPTS)的荧光光谱,结果表明、表面活性剂对其荧光特性的影响可分为两种类型:单分子猝灭(CMC以下)和胶束作用(CMC以上)。它们分别服从相应的Stern-Volmer稳态猝灭和溶质-胶束作用线性方程。按导出方程对应作图,求得CTMAB的单分子猝灭常数K=2.4×10~5L/mol;CTMAB胶束和TX100胶束对HPTS的键合常数分别为7.4×10~5L/mol和7.0×10~3L/mol。阴离子表而活性剂十二烷基硫酸钠,由于其电性与HPTS阴离子电性的不相容性,对HPTS荧光未见明显影响。

HPT-ELISA方法的建立及其在转基因水稻监测中的应用

本文改进了HPT-ELISA检测法，利用一种简便并且高效的微生物表达体系，将hpt基因的全编码序列克隆到原核表达质粒pGEX—KG上，在E．Coli菌株B121（DE3）-pLys中进行诱导表达，获得了融合蛋白GST—HPT，经Thrombin凝血酶酶切过夜，再经过柱纯化后获得不合GST且具有生物活性的HPT纯蛋白，所得蛋白纯度〉90％。MALDI—TOF—MS分析表明，HPT蛋白分子量为39．4KD。用HPT纯蛋白免疫家兔，制备了高效价的多克隆抗体，进而构建了双抗夹心酶联免疫检测方法，其灵敏度为0．31ng／ml。应用该HPT—ELISA方法，测定了不同生育期转Bt基因水稻植株中HPT蛋白的表达水平以及成熟期稻米中的HPT蛋白含量。结果表明，不同生育期转Bt基因水稻植株中HPT蛋白的表达量约为15．67-60．12ng／g·FW，转Bt基因稻米中HPT蛋白的含量为5．28ng HPT／g·FW，而在非转基因亲本的植株和稻米中均未检测到HPT蛋白。

γ-氨基丁酸对夏季高温期生长肥育猪生产性能、抗氧化及HPA、HPT轴激素分泌的影响

为探讨日粮中添加γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)对夏季高温期生长肥育猪生长性能、抗氧化及HPA、HPT轴相关激素分泌的影响,试验选用(43.07±5.76)kg"杜长大"三元杂交猪96头,随机分为4个处理,每个处理3个重复,每个重复8头。试验采用单因子设计,按日粮添加水平设基础日粮组(0 mg.kg-1GABA)、基础日粮+10 mg.kg-1GABA、基础日粮+20 mg.kg-1GABA、基础日粮+40 mg.kg-1GABA4个处理,试验期48 d。结果表明:各处理对夏季高温期生长肥育猪的生产性能都有影响,其中以10 mg.kg-1处理效果最优,全程日增体质量提高13.08%(P<0.01),料重比降低7.81%(P<0.01),但各试验组猪日采食量无显著变化。10mg.kg-1GABA使血清GSH-Px活性极显著提高(P<0.01),SOD活性提高,MDA含量下降,但未达显著水平(P>0.05);10 mg.kg-1GABA显著降低HPA轴激素皮质醇、皮质酮及ACTH水平(P<0.05),显著升高HPT轴激素T3及FT3水平(P<0.05),但对T4及FT4无显著影响(P>0.05)。综上,饲粮中添加GABA改善了夏季高温期生长肥育猪的生产性能,本研究条件下以10 mg.kg-1处理效果最优;10 mg.kg-1GABA还降低了夏季高温对猪造成的应激并使其抗氧化性能及甲状腺机能增强。

γ-氨基丁酸对生长肥育猪生长性能、血清生化指标及HPA、HPT轴激素分泌的影响

本试验研究不同水平的γ-氨基丁酸(GABA)对生长肥育猪生长性能、血清生化指标及HPA轴(皮质醇、皮质酮和促肾上腺皮质激素)与HPT轴(游离三碘甲腺原氨酸、游离甲状腺素、三碘甲腺原氨酸和甲状腺素)激素分泌的影响。选取96头体重约(43.0±3.2)kg的杜长大三元杂交猪,随机分为4组,每组3个重复,每重复8头(公母各1/2),分别饲喂在基础日粮中添加0(对照组)、10(组Ⅰ)、20(组Ⅱ)和40 mg/kg GABA(组Ⅲ)的试验日粮,试验期48 d。试验结束时测定猪生长性能,并从对照组及生长效果最佳组的每重复选2头,测定血液指标。结果表明:与对照组相比,3个水平的GABA对生长肥育猪的生产性能都有一定的影响,其中以10 mg/kg组效果最为显著,日增重提高13.08%(P<0.01),料重比降低7.81%(P<0.01)。10 mg/kg GABA使三碘甲腺原氨酸和游离三碘甲腺原氨酸水平显著升高(P<0.05);谷胱甘肽过氧化物酶活性极显著升高(P<0.01);乳酸脱氢酶活性及皮质醇、皮质酮和促肾上腺皮质激素水平显著下降(P<0.05)。结果提示,日粮添加GABA可提高生长肥育猪生产性能;10 mg/kg GABA使生长肥育猪的抗氧化性能及甲状腺机能增强。

用于植物基因研究的mCherry表达载体构建及定位表达

荧光蛋白在生物学研究中具有广泛的应用和重要的作用,其中红色荧光蛋白mCherry因其颜色和良好的特性,对于植物基因研究具有重要的使用价值,本研究将mCherry基因构建到pBI121植物表达载体系统中,构建了pBI121MCS-mCherry载体。利用基因枪转化法转入洋葱表皮进行表达验证,显微镜观察结果显示整个洋葱细胞具有红色荧光,证明该载体能够在植物细胞中表达红色荧光蛋白。利用双酶切连接法将转录因子BpMYB4基因构建到该载体上,得到融合表达载体pBI121MCS-mCherry-BpMYB4,在洋葱表皮中表达,结果显示细胞核具有红色荧光,证明该载体能够准确表达融合蛋白,进行亚细胞定位。同时融合基因时不再需要中间载体,构建简便,引入的KpnⅠ酶切位点,增加了可选择性。因此该载体可用于植物基因表达定位及转基因植株筛选研究中,为今后的白桦基因组学研究提供了材料。

抗HPT单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定

目的 :制备抗潮霉素B磷酸转移酶 (HPT)的单克隆抗体 (McAb) ,建立一种快速检测转基因作物中该选择标记基因HPT编码蛋白的方法。方法 :用基因重组潮霉素B磷酸转移酶 (HPT)抗原免疫BALB C小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb。选择不同的抗原决定簇与兔抗HPT多抗配对 ,建立双抗夹心ELISA检测HPT抗原。结果 :筛选出四株稳定分泌抗HPT单抗的杂交瘤细胞株 ,IgG亚类鉴定均为IgG1,ELISA检测证实单抗可特异性识别细胞培养上清、重组子菌体裂解产物中及纯化出的HPT蛋白。结合位点测定实验表明 4株单抗是针对不同的抗原决定簇 ,与多克隆抗体组成双抗夹心ELISA法 ,均可较好地检测到HPT抗原。检测的灵敏度为 30ng ml,且与别的无关抗原无交叉反应性。结论 :4株杂交瘤细胞株特异性好 ,亲和力强 ,组成双抗夹心ELISA法可用于快速。

不同加工条件下转基因大米潮霉素标记基因(hpt)稳定性研究

目的从DNA稳定性的角度,探讨转基因大米潮霉素标记基因hpt向食品或消化道微生物转移发生水平转移的可能性。方法利用针对hpt不同大小片段的PCR扩增体系,对hpt在转基因大米加工食品中的稳定性进行研究。结果建立的PCR体系能稳定扩增出hpt236bp-910bp不同大小的5个片段。利用这一PCR体系对s86转基因大米不同加工食品的检测显示,加工米饭、粥大于500bp的片段已降解,爆米花和锅巴大于236bp的hpt片段已降解。对照M86大米加工米饭和粥仅能扩出植物叶绿体基因rbcl片段,爆米花、锅巴及空白对照所有扩增均为阴性。结论hpt在转基因大米加工食品中均已不同程度的发生了降解,不同加工方式对hpt片段降解影响显著,在加工后hpt以较大或完整片段向食品或消化道微生物转移的可能性减小。