牛布鲁菌侵染对HPT-8细胞p38基因转录水平的影响

探讨布鲁菌侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)过程中对p38基因转录的影响。用牛布鲁菌2308和RB51株分别侵染HPT-8细胞,在不同侵染时间点(0、4、8、12、48h)收集细胞,提取总RNA,反转录获得cDNA;构建p38α、p38β和内参基因GAPDH的克隆质粒,并绘制3种基因扩增的标准曲线;RT-qPCR检测p38α和p38β基因的转录表达。结果显示,获得了HPT-8细胞侵染前后的cDNA,构建了pMD18-T-p38α/p38β/GAPDH克隆质粒,绘制了标准曲线。RT-qPCR结果显示,布鲁菌2308和RB51侵染滋养层细胞后(4、8、12、48h),p38α和p38β的相对表达量比0h均明显下降,差异极显著(P<0.01),布鲁菌RB51株和2308株也存在一定差异。结果表明,在布鲁菌侵染HPT-8细胞的过程中,p38 MAPK信号通路被下调,提示p38 MAPK信号通路参与了对细胞生物学效应的调控,且这种调控作用与菌株的毒力强弱存在密切联系。

羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞cDNA文库的构建及EST序列分析

拟建立羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库。分别提取布鲁氏菌侵染20min、1h、2h、3h、4h后HPT-8细胞总RNA,逆转录合成cDNA,同源重组法构建布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,测定其库容量和重组率,对文库63个克隆进行测序分析,采用BLASTx和BLASTn进行序列同源性比对,并将63个基因进行了功能分类。结果得到的羊种布鲁氏菌侵染人胚胎滋养层细胞HPT-8cDNA文库的库容为1.43×106,重组率是96.92%,插入片段大小为0.2-5.0kb。在63个基因中,与转录、能量代谢、运输及细胞因子相关的基因所占比例较高。构建的羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,为研究宿主细胞受体和布鲁氏菌入侵途径,进一步了解布鲁氏菌的致病机理奠定了基础。

布鲁菌基因缺失株△VceA的感染特征研究

本文研究了布鲁菌IV型分泌系统效应蛋白VceA缺失对细胞侵染和小鼠感染特征。培养布鲁菌S2308基因缺失突变株ΔVceA,测定ΔVceA在生长过程中的OD值并制作其生长曲线;在用布鲁菌VceA基因缺失株和其亲本株S2308株分别侵染HPT-8细胞后,检测细胞炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。采用ΔVceA和亲本株S2308分别侵染HPT-8细胞和感染小鼠,对HPT-8进行胞内CFU计数,对小鼠脾脏内进行CFU计数,研究基因缺失突变株ΔVceA的感染特征。结果显示,基因缺失株ΔVceA和亲本株S2308的生长曲线在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;VceA基因缺失株在侵染细胞的初期胞内CFU计数低于亲本株,之后和亲本株无显著差异;基因缺失株ΔVceA在感染小鼠初期脾脏内CFU计数时低于亲本株,在感染后期和亲本株无明显差异;基因缺失株ΔVceA在侵染HPT-8细胞12 h时TNF-α和IL-1β的分泌量缺失株显著低于亲本株。结果表明,VceA基因的缺失不影响布鲁菌的生长繁殖,在布鲁菌感染细胞后影响细胞因子的分泌,胞内外的生存繁殖力明显下降,为深入研究布鲁菌IV型分泌系统的作用和功能奠定基础。