HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白。方法利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用。结果重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认。SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体。纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%。纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用。结论AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础。

人乳头瘤病毒(地方株)16型E7蛋白的抗原性和免疫原性研究

以融合蛋白包含体形式在大肠杆菌中高效表达了人乳头瘤病毒１６型（湖北株）Ｅ７基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）。用蛋白质印迹技术（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）对该基因表达产物ＨＢＥ７融合蛋白的性质进行了鉴定。发现ＨＢＥ７融合蛋白能与ＨＰＶ１６Ｅ７单克隆抗体结合，表明该融合蛋白至少部分保留了Ｅ７蛋白的抗原特性。因此，将该融合蛋白免疫小鼠。３ｗｋ后，在小鼠血清中既检测到了抗载体蛋白的抗体，又检测到了特异性抗ＨＢＥ７抗体。实验表明：ＨＢＥ７不仅能与Ｅ７抗体产生反应，具有反应原性，而且在动物免疫中产生特异性抗体。

人乳头瘤病毒6b型E7基因的克隆和表达

目的 克隆人乳头瘤病毒 6b型E7(humanpapillomavirus 6bE7)基因 ,构建原核表达载体 ,并进行蛋白表达和纯化。方法 将HPV 6bE7基因经PCR扩增和亚克隆 ,与GST原核表达载体pGEX 4T 2重组 ,转化E .coliP2 3 92 菌表达蛋白 ,经GlutathioneSepharose 4B亲和层析纯化GST HPV 6bE7融合蛋白。结果 限制性酶切和DNA测序表明 ,HPV 6bE7DNA正确克隆于 pGEX 4T 2多克隆位点。经IPTG诱导表达的GST HPV 6bE7融合蛋白主要存在于可溶性上清。经亲和层析 ,每升诱导菌回收 8.4mg融合蛋白 ,10 %SDS PAGE分析融合蛋白表观分子量约 3 7kDa。结论 成功构建了HPV 6bE7基因原核表达载体 ,并大量表达和纯化了GST HPV

人乳头瘤病毒16型湖北株E_7基因的克隆和高效表达

利用基因克隆技术，将ＨＰＶ１６湖北株完整的Ｅ７基因克隆到含乳糖操纵子的表达载体ｐＷＲ５９０１上，经限制性酶切分析获得重组质粒ｐＷＨＢＥ７。ｐＷＨＢＥ７转化大肠杆菌后表达产生分子量为７０ｋＤ的融合蛋白ｌａｃＥ７，该蛋白在免疫印迹实验中可被标准Ｅ７单抗识别。经ＩＰＴＧ诱导后，Ｅ７融合蛋白产量可达细菌总蛋白含量的３０％以上。利用ｌａｃＥ７蛋白在细菌胞浆中形成包含体的性质，简便地提取并纯化了该蛋白质。结果为从免疫学角度探讨ＨＰＶ１６与宫颈癌的关系以及ＨＰＶ疫苗的研制打下基础。

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32(+)/HPV16 E5为模板,PCR获得E5基因,经SalⅠ和NotⅠ双酶切插入已构建好的pGEX4T-1/HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1/HPV16L1-E5。pGEX4T-1/HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1/HPV16L1-E5,在1mmol/L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1/HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。

中国地方株人乳头瘤病毒16型E7基因的高效表达

人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）至今没有合适的体外培养系统。为了研究ＨＰＶ１６Ｅ７蛋白的免疫学性质，采用分子克隆技术构建了我国地方株（湖北株ＨＢ）ＨＰＶ１６Ｅ７基因重组表达质粒。经鉴定显示：该基因在大肠杆菌中得到高效表达，分子量约为６９ＫＤ，为ＨＰＶ１６－ＨＢＥ７与载体蛋白（β－半乳糖苷酶α肽）融合蛋白。融合蛋白表达量占整个菌体蛋白含量的３０％～４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果表明：融合蛋白保留了ＨＰＶ１６Ｅ７抗原决定簇的抗原性，能与Ｅ７单克隆抗体特异性结合。

采用杆状病毒表达系统表达EGFP标记的HPV-16L1病毒样颗粒

目的制备增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的人乳头状瘤病毒16型（HPV-16）病毒样颗粒，为研究HPV-16L1的生物学活性提供一种方法。方法采用Xbal＋HindⅢ双酶切pGEM-T-HPV-16质粒，获得HPV-16L1基因片段，用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因片段，NcoⅠ＋SalⅠ双酶切，依次克隆入杆状病毒转移载体，获得重组pFB-EGFP-HPV-16L1转移载体；在DHIOBac内通过转座子Tn7的介导，获得重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒；感染Sf-9昆虫细胞；荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法确定融合蛋白的荧光特性及细胞学定位；利用Western blot分析融合蛋白的表达；电子显微镜观察病毒样颗粒（VLP）的形成；利用小鼠红细胞凝集试验及凝集抑制试验分析生物学活性。结果重组pFB-EGFP-HPV-16L1辅助表达载体及重组杆状病毒中EGFP-HPV-16L1融合基因构建正确；荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染重组杆状病毒AC-EGFP-HPV-16L1的Sf-9细胞核内可见耀眼的绿色荧光，免疫组织化学证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白主要位于Sf-9细胞核内；Western blot证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白相对分子质量（Mr）为83×10^3，与理论值一致；透射电子显微镜观察发现感染重组Ac-EGFP-HPV-16L1杆状病毒的Sf-9细胞核内和裂解上清内均可发现大量形态均一的vIJP形成；小鼠红细胞凝集试验证实EGFP-HPV-16L1融合蛋白可引起小鼠红细胞凝集，且可被抗HPV-16L1单克隆抗体抑制。结论杆状病毒表达系统表达的EGFP标记的HPV-16L1蛋白既能自组装成病毒样颗粒、具有构象依赖性生物学活性，又能发射易于检测的绿色荧光，有可能用于HPV-16L1蛋白的生物行为研究，并实时可视化追踪其在宿主细胞内的转运过程。

乳头瘤病毒表位融合蛋白的基因定点诱变

目的定点诱变热休克蛋白-乳头瘤病毒表位融合蛋白的基因中编码半胱氨酸的密码子,解决下游纯化工作中产生多聚体蛋白的问题。方法在对蛋白质序列进行计算机表位预测及生物学特性分析的基础上,利用PCR的定点诱变技术,使原始基因序列中编码半胱氨酸的TGC突变为编码甘氨酸的GGC,克隆并表达了该基因编码的蛋白质。结果经克隆、测序后证实已成功获得突变基因,其编码的融合蛋白经纯化后没有多聚体的产生。结论利用PCR定点诱变技术对基因进行突变,在不改变蛋白质抗原性质的基础上,优化蛋白质序列,提高蛋白质纯化质量和效率。

三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ的表达及抗单纯疱疹病毒/人乳头瘤病毒功能研究

目的原核表达三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ(简称MSIK),并在细胞和小鼠水平上对其抗人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的功能进行研究。方法构建三元融合蛋白MSIK的原核表达质粒pET30-MBP-SERPINA3-IFN-κ,将构建好的质粒转入EL21(DE3)codon Plus大肠埃希菌并利用异丙基硫代半乳糖昔(isopropyl-β-D-thiogalactophyranoside,IPTG)诱导蛋白的表达,经亲和层析纯化得到蛋白,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD&PAGE)验证目的蛋白的纯度,用1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)分别在角质细胞中及BALB/c小鼠上验证该蛋白的抗病毒活性,通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测样本中病毒的含量。结果该融合蛋白经IPTG诱导表达并由亲和层析纯化后,获得相对分子质量约为100×10^3的纯化蛋白,经SDS-PAGE法检验,并使用Image J进行灰度分析,该融合蛋白纯度大于95%。在角质细胞中,该三元融合蛋白能够有效抑制HSV-1病毒的复制,在小鼠皮肤创伤模型中,该三元融合蛋白同样能够有效抑制HSV-1病毒的复制并能够促进创口的愈合。结论成功表达了三元融合蛋白MSIK,并利用亲和层析柱进行了有效的纯化。获得的融合蛋白具有良好的生物学活性,能够有效抑制HSV-1病毒的复制并促进创口的愈合。该三元融合蛋白可用于研发有效的抗HPV护创敷料,用来治疗一些由HPV引发的相关疾病。