携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组短双歧杆菌抗小鼠宫颈癌移植瘤的疗效和安全性

目的:评价口服携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组短双歧杆菌在小鼠体内抗宫颈癌移植瘤的效果。方法:将p MG36e-E7 shRNA、pMG36e-mIL-12D质粒分别转化短双歧杆菌,经筛选鉴定并扩增获得携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组短双歧杆菌。通过小鼠皮下宫颈癌细胞移植建立荷瘤小鼠模型。口服重组短双歧杆菌1、7 d后,检测小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织匀浆液或血清在PYG培养基中形成的菌落数量,评价短双歧杆菌的肿瘤靶向性,以小鼠体内肿瘤生长曲线评估重组短双歧杆菌的抗肿瘤效果,通过主要器官切片H-E染色和检测荷瘤小鼠血清相关细胞因子水平评价口服重组短双歧杆菌的安全性。结果:成功制备重组短双歧杆菌和宫颈癌TC-1细胞移植瘤小鼠。7 d后,移植瘤组织匀浆液和血清的菌落数量证实短双歧杆菌具有靶向体内瘤组织的定殖能力,口服重组短双歧杆菌明显抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长(P<0.05或P<0.01),但联合使用携带HPV16 E7 shRNA和IL-12基因的重组双歧杆菌的肿瘤抑制率与单独使用的并无显著差异,治疗后未见对荷瘤小鼠主要器官的损伤和血清中IL-12及IFN-γ的水平明显变化。结论:短双歧杆菌可用作靶向肿瘤的治疗性基因分子递送载体,其对宫颈癌移植瘤的疗效明显且安全可控。

表达HPV-16 E6基因siRNA真核载体的构建及体外转染效率鉴定

目的:采用RNA干扰技术选择性的沉默宫颈癌Ca Ski细胞株中HPV-16 E6基因的表达。为观察HPV-16 E6基因的小干扰片段能否在Ca Ski细胞特异性的抑制E6基因的表达,构建能在哺乳动物细胞中表达E6小干扰RNA的真核表达质粒,并观察其转染效率。方法:根据HPV-16 E6基因序列,设计特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至Ca Ski细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率。结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功的构建二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功的转染到Ca Ski细胞株中,转染效率达到50%以上。结论:siRNA真核表达载体的构建及体外转染的成功为下一步研究奠定了良好的基础。

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16 E6基因的pSUPER.retroRNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染入包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RT-PCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RT-PCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。

抑癌基因PRDM5在HPV16病毒致宫颈鳞癌发生过程中的作用研究

目的探讨抑癌基因PRDM5表达下降是否是HPV16病毒感染导致宫颈癌发生的机制之一。方法采用免疫组化法检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中PRDM5蛋白及HPV16 E6/HPV18 E6蛋白的表达; HPV16 E6 shRNA质粒转染Si Ha细胞后,应用RT-PCR及Western blot法检测PRDM5的表达。结果 HPV16/18 E6在宫颈癌组织中表达阳性率明显高于正常宫颈组织;宫颈癌组织中PRDM5蛋白表达水平较正常宫颈组织中表达水平低;将HPV16 E6 shRNA3转染SiHa细胞干扰HPV16 E6表达后,发现Si Ha细胞中PRDM5 mRNA及蛋白表达上调。结论 PRDM5可能介导HPV16病毒感染导致宫颈癌的发生发展过程。

保妇康栓治疗宫颈炎合并HPV感染的临床研究

目的研究分析保妇康栓治疗宫颈炎合并HPV感染的临床效果。方法方便选取84例该院于2018年2月—2019年6月收治的宫颈炎合并HPV(人乳头瘤病毒)感染患者。应用随机分组的方式将其分为干扰素栓组(42例,应用干扰素栓治疗)与保妇康栓组(42例,应用保妇康栓治疗),对比两组患者治疗前后宫颈炎RLU/CO检测值、治疗效率与HPV的转阴率。结果治疗前,保妇康栓组患者RLU/CO检测值为(176.65±54.32),与干扰素栓组(176.39±54.29),相比差异无统计学意义(t=0.029,P=0.982>0.05),治疗后保妇康栓组患者RLU/CO检测值(15.27±13.95)明显低于干扰素栓组的(24.86±6.94),差异有统计学意义(t=3.989,P=0.001<0.05),同时保妇康栓组患者在宫颈炎的治疗率95.24%以及HPV的转阴率90.48%均高于干扰素栓组(76.19%、69.05%),差异有统计学意义(χ^(2)=6.222、5.974,P=0.014、0.015<0.05)。结论应用保妇康栓治疗宫颈炎并HPV感染其效果更加明显,可有效提高宫颈炎患者的治疗率,同时在提高HPV的转阴率上也有显著功效。

RNA干涉技术在宫颈癌相关HPV及RARβ2研究中的应用

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,其发生与发展是多因素共同参与的结果。除高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的关系密切外,肿瘤抑制基因的表达沉默是十分重要的参与因素,且多为表观调节引起。其中维甲酸受体β2(RARβ2)的表达沉默相当普遍,但上述二者致病的关系不明。RNA干扰(RNAi)是近年来发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术,可以通过在细胞内引入设计的外源双链RNA诱导细胞内特定基因的沉默,从而观察相关生物因子的变化。该文就在有关宫颈癌细胞系中通过RNAi干扰HPV表达观察RARβ2表达及其表观遗传学改变的最新结果进行综述,旨在了解HPV与RARβ2之间的关系,进一步探索对宫颈癌发生机制的认识。

ADAM28 shRNA干扰载体对人牙周膜干细胞增殖、分化和凋亡的影响

目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)shRNA干扰载体对人牙周膜干细胞(HPDLSCs)增殖、分化和凋亡的影响及作用机制。方法:用ADAM28 shRNA干扰载体转染HPDLSCs 48 h后检测转染效率,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞周期。酶动力学法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blot检测分化相关基因CAP、Pax9蛋白的表达。FCM测定HPDLSCs凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达差异。用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果:重组干扰载体PGPU6/GFP/Neo-ADAM28-shRNA可高效转染HPDLSCs,干扰载体组的细胞增殖活性显著下降,S期、G 2+M期的细胞比例和细胞增殖指数(PI=S+G 2M)明显降低,ALP值明显降低,CAP、Pax9蛋白的表达水平下降,凋亡率显著提高,Bcl-2、Bax蛋白的表达水平上调。结论:ADAM28 shRNA干扰载体抑制HPDLSCs的增殖、分化,诱导HPDLSCs凋亡。其机制可能是干扰载体抑制金属蛋白酶域和类解离素域的催化裂解和类EGF功能域的促细胞增殖作用,阻碍Notch信号传递并参与细胞凋亡负反馈调节机制。

绵羊PLC-γ1基因shRNA慢病毒干扰载体的构建及鉴定

为了构建绵羊PLC-γ1基因shRNA慢病毒干扰载体,并在人胚肾细胞(HEK-293T细胞)中筛选及鉴定载体干扰效果,试验采用Invitrogen BLOCK-iTTM RNAi Designer在线软件设计PLC-γ1基因的4条shRNA干扰序列(PLC-γ1-shRNA-1~4)和1条阴性对照序列(PLC-γ1-shRNA-NC),将其分别克隆至慢病毒干扰载体pLentiLox3.7(pLL3.7)中构建PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体,用其转染HEK-293T细胞,48 h后通过倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况,并利用实时荧光定量PCR法和Western-blot检测HEK-293T细胞中PLC-γ1基因和蛋白质的表达情况,筛选出干扰效率最高的PLC-γ1-shRNA干扰序列并计算慢病毒含量。结果表明:试验成功设计出PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体,大小为120 bp。PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体均具有较高的干扰效率,在倒置荧光显微镜下均可观察到绿色荧光蛋白表达,其中PLC-γ1-shRNA-2序列的干扰效率最高,其PLC-γ1基因和蛋白质的相对表达量最低,极显著低于PLC-γ1-shRNA-NC的干扰(P<0.01),慢病毒含量为1.1×10^(7)IU/mL。说明针对PLC-γ1基因筛选出的PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体从基因和蛋白质水平上均能有效地抑制PLC-γ1的表达。

shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpinRNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducibleFactor-1,HIF1)基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1。以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1。新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变。结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。

靶向整合于MHCC97-H细胞的HBx基因shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向整合于人肝癌MHCC97-H细胞乙型肝炎病毒x基因(HBxgene)基因的shRNA真核载体。方法依据从人肝癌细胞株MHCC97-H中克隆的HBx基因序列,设计合成X169、X220及MOCK(无关对照)3对寡核酸,经退火成互补双链并克隆至pGenesil-Ⅰ载体;经酶切、PCR和测序鉴定;将鉴定的shRNA质粒脂质体转染MHCC97-H细胞,流式细胞分析转染效率。结果酶切、PCR及测序证实pshRNA-X169/X220/MOCK质粒构建符合设计,转染48h后MHCC97-H细胞可激发绿色荧光,pshRNA-X220转染效率最低。结论成功构建靶向整合于人肝癌细胞HBVx基因特异性shRNA表达载体,并成功转染人肝癌细胞株MHCC97-H细胞,为沉默HBx基因实验性肝癌基因治疗奠定基础。

红色荧光蛋白核迁移蛋白shRNA干扰载体的构建

目的:利用红色荧光蛋白(RFP),建立一种直观、快速筛选有效RNA干扰片段的方法。方法:通过分子克隆技术将核迁移蛋白(NUDC)与RFP构建成融合基因,克隆至真核表达载体pDs中,以实现其融合表达;同时,将人U6启动子及9个NUDC的发夹结构分别克隆至上述同一真核载体中,构建成一系列针对NUDC不同干扰位点的RNA干扰载体,通过采用酶切及DNA序列鉴定,然后转染293T细胞,通过荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数。结果:酶切及测序结果证实质粒为所需的序列;荧光显微镜观察结果显示,shNUDC-A的干扰效果最好。结论:成功构建了含RFP的NUDC真核shRNA干扰载体。

Survivin shRNA真核表达载体的构建及其生物学作用

目的:构建存活素(survivin)基因短发夹RNA(shR-NA)的表达质粒,为乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.方法:设计并合成有小发夹结构的8条survivinshRNA对应模板序列,退火并与pShuttle 1.0-CMV载体重组质粒;将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF-7;MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度,流式细胞术检测细胞周期的变化,经Hoechst染色观察凋亡情况,RT-PCR和Western Blot检测survivin基因的表达情况.结果:成功构建重组质粒并筛选出最有效质粒及其有效浓度;细胞受阻于G2/M期,并通过荧光染色发现有凋亡细胞;survivin基因表达受到抑制.结论:构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达,这为研究乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.

shRNA干扰沉默RNPC1a基因对SUM1315细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:研究RNPC1a基因对SUM1315细胞增殖、迁移及侵袭的影响。方法:应用脂质体技术将RNPC1a短发夹RNA(shRNA)转染至SUM1315细胞,通过嘌呤霉素筛选出稳定细胞株,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测其干涉效率,并用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,划痕实验及Transwell细胞侵袭实验检测其迁移和侵袭能力。结果:经qRT-PCR和Western blot方法证实稳定转染RNPC1a shRNA的SUM1315细胞中RNPC1a的mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P<0.05),同时RNPC1a干扰后细胞的增殖、迁移及侵袭能力均减弱(P<0.05)。结论:RNPC1a shRNA能有效地降低SUM1315细胞中RNPC1a基因的表达,RNPC1a基因沉默可以抑制SUM1315细胞的增殖、迁移及侵袭。

shRNA表达质粒体外防治猪传染性胃肠炎病毒感染

猪传染性胃肠炎病毒是引起猪胃肠道感染的主要病原之一,新生仔猪感染后死亡率很高,给养猪业带来重大经济损失。为了探索运用RNA干扰技术防治猪传染性胃肠炎病毒感染的可能性,我们构建了两个靶向病毒基因组的小发卡RNA (shRNA)表达质粒pEGFP-U6/P1和pEGFP-U6/P2,并分别转染猪睾丸(ST)细胞。通过细胞增殖试验(MTS)和定量RT-PCR检测试验表明,这两个质粒均可高效特异地抑制猪传染性胃肠炎病毒的复制。研究结果表明,RNA干扰(RNAi)技术可以用来有效防治猪传染性胃肠炎。

PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列

有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效siRNA片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的siRNA。

慢病毒载体介导shRNA干扰对乳腺癌MCF-7细胞RSK4基因表达的影响

目的观察慢病毒干扰载体(RSK4-RNAi-LV)转染对低侵袭、低转移潜能的乳腺癌MCF-7细胞中核糖体S6蛋白激酶4(ribosomal protein S6 kinase 4,RSK4)基因表达的影响。方法设计合成特异性的RSK4 shRNA干扰体RSK4-RNAi-LV,稳定转染至乳腺癌MCF-7细胞中,应用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测RSK4 mRNA及其蛋白的表达情况。结果稳定转染慢病毒干扰载体至乳腺癌细胞后,72h开始检测到GFP荧光表达,90h后GFP荧光表达明显增强,RSK4 mRNA及其蛋白的表达均被明显抑制,抑制率分别为98.2%和80.1%。结论稳定转染RSK4-RNAi-LV可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞中RSK4 mRNA及其蛋白的表达。

单纯疱疹Ⅱ型病毒UL29基因shRNA表达载体的干扰效应

目的:应用RNA干扰技术,针对单纯疱疹Ⅱ型病毒(HSV-2)UL29基因构建短发夹RNA重组表达载体,观察其对HSV-2的干扰效应。方法:针对HSV-2 UL29基因筛选出4条拟干扰靶位点序列,分别设计、合成4组靶向UL29基因shRNA的基因真核表达载体。通过脂质体转染到HEK293细胞。再将HSV-2接种到HEK293细胞中。采用终点滴定法检测病毒滴度,RT-PCR检测shRNA对转录水平的影响,Western-blot检测shRNA对蛋白质表达水平的影响。结果:终点滴定法结果显示UL29shRNA各组均可不同程度降低病毒感染滴度,与空白组(未转染重组表达载体)比较差异显著(P<0.01)。RT-PCR结果显示,与空白组比较,4组抑制率分别为28.80%、59.95%、66.08%、36.27%,差异均具有显著性(P<0.05),shRNANC(不针对任何基因的序列)与空白组相比差异无显著性,其中以UL29shRNA1461组效果为最佳。Western-blot检测表明UL29shRNA各组ICP8蛋白表达水平比阴性对照组明显降低。结论:UL29shRNA能有效干扰HSV-2UL29基因的表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。

肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体的构建

目的构建肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体。方法 PCR扩增Survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定。体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA并酶切、测序鉴定。用Survivin启动子替换pGenesil-FAK shRNA中的U6启动子,重组为Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体pGenesil-pSurv-FAK shRNA。将pGenesil-pSurv-FAK shRNA转染至肝癌细胞系HepG2,观察转染效率。48h后应用RT-PCR法检测转染重组质粒后HepG2细胞中FAK mRNA的表达变化。结果成功构建了肿瘤特异性Survivin启动子驱动的真核表达载体pGenesil-pSur-FAKshRNA,转染至肝癌细胞HepG2后可明显下调HepG2细胞中FAK mRNA表达水平。结论以Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体能够有效下调肝癌细胞FAK的表达,为进一步以靶向干扰FAK表达为主要手段的肝癌联合治疗提供实验依据。

shRNA干扰蛋白激酶D-2基因提高Tca8113对化疗药物的敏感性研究

目的探讨蛋白激酶D(PKD)-2基因沉默对Tca8113细胞增殖、细胞程序性死亡及对化疗药物敏感性的影响。方法构建针对pkd-2基因的shRNA干扰质粒及空载体对照组质粒,建立pkd-2基因沉默的稳定细胞株;采用甲基噻唑基四唑(MTT)方法检测shRNA干扰后细胞株的增殖情况及对化疗药物的半数抑制质量浓度(IC50);采用流式细胞术检测pkd-2基因沉默前后细胞程序性死亡率及对化疗药物的敏感性;采用免疫组化方法检测pkd-2沉默后细胞中P糖蛋白(P-gp)的表达。结果筛选并建立pkd-2基因沉默的稳定细胞株;经shRNA干扰后Tca8113细胞的增殖速度与野生型细胞相比差异无统计学意义,但IC50明显降低;pkd-2沉默后Tca8113细胞程序性死亡率明显上升,且对化疗药物的敏感性显著提高;与野生型对照组Tca8113相比较,shRNA-pkd-2基因沉默的Tca8113经化疗药物诱导后P-gp表达明显下降。结论 shRNA干扰技术特异性沉默Tca8113中的pkd-2基因,促进了肿瘤细胞的程序性死亡,降低对化疗药物的IC50,并明显提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,同时降低了P-gp的表达。