草地早熟禾无融合生殖胚囊发育的转录组学分析

为探究草地早熟禾无融合生殖胚囊发育过程中基因表达谱的变化,本研究利用高通量Illu-mina Hiseq测序技术对‘清水’草地早熟禾无融合生殖子房发育的无孢子起始细胞发生时期(8DBA)和无孢子生殖胚囊发育时期(6DBA、4DBA和2DBA)共4个阶段的小穗进行转录组测序。结果显示,不同差异分组(2DBA vs 4DBA、2DBA vs6DBA和2DBA vs 8DBA)共有13575个DEGs,包括7191个上调基因和6384个下调基因。GO富集分析发现,3个差异分组的DEGs显著富集在过氧化氢的响应、蛋白质重折叠、营养水库活动、错误折叠蛋白结合和双糖生物合成等过程中。KEGG通路分析表明,3个差异分组的DEGs显著富集在代谢途径、次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢及内质网中的蛋白加工等通路上,在2DBA vs 8DBA分组中发现植物激素信号转导途径的富集。4个时期占比最多的转录因子家族是NAC、AP2/ERF-ERF和MYB-related等。将在4个发育阶段特异性高表达的基因OPR1、ASN2、SAMS2、HSP81-2、PXG4和FPK2作为与‘清水’草地早熟禾无融合生殖胚囊发育相关的候选基因。qRTPCR分析表明,除WOX2在4DBA上调,与RNA-seq的表达存在差异外,其余16个DEGs的表达量变化趋势与高通量测序结果基本一致。

HPV18融合转录本E1/CCAT1在宫颈癌筛查中的应用

目的探讨融合转录本E1/CCAT1在人乳头瘤病毒(HPV)18感染的宫颈组织和上皮细胞中的表达及临床意义。方法选取2016年2月至2020年3月浙江省中医院收治的HPV18感染宫颈癌前病变及宫颈癌患者共62例和宫颈癌筛查者105例作为研究对象。收集所有患者经手术或活检获取的宫颈组织和筛查者宫颈脱落上皮细胞标本,培养Hda细胞。以非HPV18感染或因良性疾病切除的宫颈组织作为对照,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测HeLa细胞株及收集样本的融合转录本E1/CCAT1和C-MYC的表达。结果在HPV18阳性的部分宫颈组织标本和HeLa细胞株中均发现E1/CCAT1(E1_1489084/Chrom8_128,231,211)的表达。E1/CCAT1和C-MYC的相对表达量均随着宫颈分级程度加重而逐级升高,且E1/CCAT1在宫颈病变组织中的相对表达水平与C-MYC呈正相关(P<0.01,r=0.8862)。105例HPV18阳性的宫颈脱落上皮细胞中有10例检测出E1/CCAT1融合转录本,后续随访经阴道镜活检为低或高度上皮内瘤变患者。结论HPV18可能通过与宿主细胞转录融合形成E1/CCAT1转录本参与宫颈癌的病变过程,有望成为宫颈癌筛查的新标志物。

宫颈癌及癌前病变组织中含HPV16E7基因转录本分析

目的:探讨宫颈癌发生发展过程中不同病变时期人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7相关转录本的变化。方法:乳头瘤病毒癌基因转录本扩增(APOT)检测15例低度鳞状上皮内病变(LSIL)、20例高度鳞状上皮内病变(HSIL)、18例宫颈癌及9例HPV阴性正常宫颈组织中的E7基因转录本;对转录本进行测序和序列比对分析;Southern blot验证E7相关转录本在宫颈癌组织中的表达。结果:与LSIL组织比较,HSIL及宫颈癌组织存在更加复杂、多样的E7基因转录本,但未见特征的转录本。宫颈组织共获得5种HPV16 E7的转录模式,模式A、C和E是本研究首次报道;在5种转录模式中,模式A与B在所有HPV16阳性的宫颈组织中都能检测到,是HSIL组织的主要转录模式;模式C主要在宫颈癌组织中检测到,其次为HSIL组织;而模式D和E却只在宫颈癌组织中被发现;模式D和E转录都含E4序列,部分宫颈癌标本未能检测到含E4转录本,且不同宫颈癌标本检测的含E4转录本也存在明显差异条带。结论:HPV16 E7的转录模式在宫颈癌变各时期中的差异都较大;随着细胞癌变程度的加深,病毒的某些特定转录模式会逐渐增多而形成优势转录。

慢性髓性白血病异基因造血干细胞移植后M-bcr/abl及m-bcr/abl融合转录子追踪观察

为研究慢性髓性白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (SCT)后M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子表达特征 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术测定 72例CML患者SCT后不同时间骨髓M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子的表达。结果显示 ,CML患者移植后 <6个月M bcr/abl阳性率 (79.2 % ,4 2 /5 3)显著高于 6 - 12个月(34.3% ,11/32 )及≥ 12个月 (35 .1% ,13/37) (P <0 .0 0 1) ,各时间段M bcr/abl阳性患者的临床复发率分别为1 9% (1/5 3) ,0 (0 /32 )及 16 .2 % (6 /37) ;6例临床复发患者中有 5例复发时M bcr/abl与m bcr/abl同时阳性。 14例遗传学缓解患者移植 6个月后M bcr/abl阳性的 17份标本无 1例m bcr/abl阳性。结论 :多数CML患者移植后M bcr/abl仍为阳性 ,一般在 6个月内转阴 ,移植后M bcr/abl阳性的患者不一定复发 ,同时追踪观察M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子可能会有助于监测残存白血病。

逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

目的 研究HPV16E7(humanpapillomavirus 16E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞 ,检测HPV16E7基因的整合与表达 ,并用生长曲线、血清依赖试验 ,电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察 ,了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出了能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆 ,已传代 5 0代 ,PCR及RT PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录 ,转化细胞的生长速度要高于正常软骨细胞 ,二者都对血清有较大程度的依赖 ,转化细胞的核质比大 ,核仁明显 ,S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强 ,可连续传代达 5 0代。

真核生物基因组转录诱导融合基因的研究进展

真核生物的基因组由基因和基因间区组成.基因转录时,从转录起始点开始到该基因的转录终止点结束,形成独立的转录单元.然而有少量的文献表明,转录有时会通读基因间区,产生包含上游基因、基因间区和下游基因的融合基因转录本.融合转录本经基因间剪接而成为有功能的成熟转录本.对真核生物转录诱导融合基因的基因间剪接方式、产生机制和意义进行了综述.

人乳头瘤病毒16 E7(HPV16E7)逆转录病毒载体的构建

目的 构建人乳头瘤病毒 16型E7基因片段 (HPV16E7)的逆转录病毒载体。方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段 ,并用酶切、连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上 ,然后再用酶切、测序进行鉴定。通过Genbank的数据库分析软件对HPV16E7进行同源性分析。结果 经酶切分析、测序证明 ,从HPV16cDNA克隆的 30 0bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组 ,HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源性。结论 构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体 ,为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。

EB病毒LMP2A和EB病毒BZLF1融合基因反转录病毒表达载体的构建

目的：将LMP2A和BZLF1基因进行融合同时可发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用，协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞。实验拟构建含EB病毒潜伏膜蛋白2A编码基因和即刻早期基因融合基因的反转录病毒表达载体，并筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法：实验于2006—08／2007—08在济宁医学院微生物教研室和青岛大学医学院微生物教研室进行。应用反转录-聚合酶链反应分别获得潜伏膜蛋白2A和即刻早期基因编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸技术将两段基因通过多肽接头（Gly4Ser）3的DNA序列进行连接．构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro-Z2A，脂质体法将pMSCVpuro-Z2A转染反转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果：限制性酶切、PCR及测序鉴定证实Z2A正确插入逆转录病毒表达载体，筛选获得了稳定产毒的嘌呤霉素抗性细胞克隆，收获病毒的滴度为7．8×10^6CFU／L，且重组逆转录病毒在PT67细胞能有效转录。结论：携带Z2A基因的重组反转录病毒表达载体pMSCVpuro-Z2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组反转录病毒，进而筛选获得了能转录表达Z2A的产毒细胞系PT67-Z2A。

E2A-PBX1融合基因阳性的儿童急性淋巴细胞白血病携带变异型融合转录本

为了研究儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中E2A-PBX1融合基因的表达,采用位于E2A基因不同位置的上游引物与下游PBX1引物,检测了410例儿童ALL,包括362例B细胞ALL和48例T细胞ALL。结果发现:17例患儿携带E2A-PBX1融合基因,检出率4.1%,且全部为B细胞ALL,而且所有阳性病例均表达一种变异型融合转录本,后者是由E2A基因的第13外显子(159bp)被差异剪切形成的。经BLASTn比对分析,这种转录本保持了原来的开放阅读框,但导致53个氨基酸残基的丢失。这53个氨基酸残基位于活化区2,会导致融合蛋白中部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。结论:携带E2A-PBX1融合基因的儿童ALL表达典型和变异型2种融合转录本,后者是由E2A基因第13外显子被差异剪切而形成的,它将导致融合蛋白中53个氨基酸残基及其所构成的部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。

AOC-ipt转录融合基因转化热研5号柱花草

以无菌热研5号柱花草子叶为材料,采用农杆菌介导把AOC-ipt基因转录融合转化热研5号柱花草,通过10 mg/L的潮霉素筛选,获得约500余株抗性苗,通过PCR检测获得23株阳性苗,对这23株阳性苗进行RT-PCR检测,其中14株为阳性。对这14株转基因苗进行了抗盐性初步观察,转基因苗并没有明显地提高热研5号柱花草的抗盐能力。

转录介导融合基因RBM6-RBM5在肿瘤细胞及组织中的表达

目的:鉴定RBM6-RBM5融合基因的存在,研究其与肿瘤发生的关系。方法:采用GLC20、MDA、MB、231、Jurkat、TF-1、MCF-7、Hela、BT-474、A431、K562及Raji10种肿瘤细胞株,肺、卵巢、骨骼肌、皮肤、脾脏、子宫、心脏、骨、脑、淋巴结、胰腺、前列腺及睾丸等肿瘤组织及其相应正常对照组织的cDNA,5例乳腺癌组织,以巢式PCR方法检测融合基因的存在,并通过QPCR方法研究融合基因的产生与RBM6、RBM5基因表达水平之间的关系。结果:RBM6-RBM5融合基因首次在MDA、MB、231细胞株中获得鉴定,序列分析发现该基因为RBM6和RBM5的融合体,该融合体不包括RBM6的外显子20、21以及RBM5的外显子1。该融合基因在10种肿瘤细胞株及部分肿瘤组织中表达,但在正常组织中却未见表达。融合基因的表达与RBM6和RBM5 mRNA的表达有关;RBM6和RBM5 mRNA的表达水平在融合基因阳性的肿瘤组织中明显高于融合基因阴性的肿瘤组织。结论:融合基因的表达与肿瘤发生有关,高水平的RBM6和RBM5 mRNA水平可能是融合基因产生的原因之一。

人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究

目的:以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18(hIL-18)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)融合基因,并观察其生物学功能。方法:健康人单核细胞经RT-PCR扩增hIL-18后、T-A克隆。亚克隆至经N heⅠ、H indⅢ酶切的PCDNA 3.1(+)/hTERT中,限制性内切酶验证后,挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT/hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T 3细胞中表达,经W estern-b lot验证目的基因表达产物,同时对转染细胞作免疫荧光染色。以EL ISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌γ干扰素的能力,以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果:hTERT/hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA 3.1(+)构建成功,经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析,该基因片段与NCB I基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9%;而细胞转染后经W estern-b lot验证,hTERT/hIL-18融合蛋白的分子量约127 kM r,与预期一致,荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素,并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论:本实验构建的PCDNA 3.1(+)/hTERT-hIL-18质粒能够在真核细胞中表达,并具有生物学功能,为进一步转染树突状细胞,研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。

用实时定量PCR检测慢性髓系白血病患者的bcr/abl^(P210)融合基因转录本

目的 建立实时定量PCR(RQ PCR)检测慢性髓系白血病(CML)bcr/ablP210融合基因转录本,评价其在CML诊断和微小残留病(MRD)监测中的意义。方法 设计TaqMan探针和引物,建立RQ PCR法对b3a2和ABL阳性模板进行扩增,并检测22例CML患者bcr/ablP210转录本含量。结果 RQ PCR法最低可检测到 10个拷贝 /μl的阳性模板,但重复性较差,而 108 ~102 拷贝 /μl的重复性良好,正常对照无扩增信号。19例初诊CML患者bcr/ablP210转录本绝对含量为 1. 42×102 ~2. 24×105拷贝 /50ng(中位数量 3. 06×104 拷贝 /50ng),ABL纠正后的相对含量为 3% ~687% (中位数 147% )。2例患者骨髓移植后bcr/ablP210转录本下降, 1例患者由慢性期进展为加速期时含量显著增高。结论 RQ PCR方法敏感、可靠,可用于CML患者的诊断和MRD随访监测。

应用实时定量PCR技术检测慢性粒细胞白血病患者bcr/abl^(P190)融合基因转录本

目的研究bcr/ablP190融合基因转录本在慢性粒细胞白血病(CML)中表达水平及其临床相关性。方法应用实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测74例CML患者骨髓单个核细胞中的bcr/ablP190转录本。结果bcr/ablP190转录本阳性54例(77.1%),中位含量2.60(1.08~8.58)×10-3,与性别、年龄、白细胞总数、血红蛋白含量、血小板计数、bcr/ablP210转录本类型和表达水平均不相关,但bcr/ablP190阳性患者的白细胞总数和血小板计数较阴性者明显降低。bcr/ablP190转录本水平在急变期与慢性期患者以及不同类型急变患者中都无差异,而细胞遗传学完全缓解患者的bcr/ablP190水平较慢性期患者、干扰素无效患者和急变期患者则明显下降。结论不同阶段CML患者体内大都存在着不同的bcr/abl剪切型转录本,不同剪切型的存在具有一定的血液学相关性。

实时定量反转录聚合酶链反应检测患儿急性粒细胞性白血病1-ETO融合基因的临床意义

目的分析实时定量RT-PCR在检测急性粒细胞性白血病（AML）1-ETO融合基因阳性AML微小残留病中的临床意义。方法对2000年1月-2007年1月收治的32例AML1-ETO阳性AML患儿进行实时定量RT-PCR检测。诱导化疗结束后及在巩固化疗阶段每1.5-2.0个月行AML1-ETO融合基因定量检测。使用Kaplan-Meier法分析不同融合基因水平患儿生存率。采用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果共32例患儿进行诱导化疗,其中29例（90.625%）达到形态学完全缓解,3例形态学未缓解后放弃。达到分子生物学缓解患儿有更高的无瘤生存率（P=0.0018）。AML1-ETO高拷贝数组生存率低于低拷贝数组（P=0.1080）。诱导缓解化疗结束后AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率低于定量〈10^-3组生存率（P=0.0230）。化疗6个月时AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率高于定量〈10^-3组生存率（P=0.0001）。巩固化疗结束时AML1-ETO定量〉10^-5组生存率低于定量〈10^-5组生存率（P=0.0049）。结论定量评估AML1-ETO阳性的小儿AML微小残留病十分重要,有可能对治疗方案的选择提供重要信息。

海莲耐盐基因AOC克隆及转录融合表达载体的构建

利用RT-PCR的方法从红树林海莲中克隆丙二烯环化氧化酶基因(AOC),并进行序列测定和BLAST程序进行同源序列分析。从RT-PCR得到的产物,其核苷酸序列与GeneBank中海莲丙二烯环化氧化酶基因AO(CBAB21610)的核苷酸序列完全相同。AOC基因通过中间载体pBS-AOC,pJIT60-AOC,最后克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到双35S的pGreenII0229-AOC植物表达载体。AOC基因和ipt基因通过中间载体pBS-AOC,pBS-ipt,pBS-AOC-ipt,pJIT60-AOC-ipt;最后将AOC和ipt基因以转录融合的方式克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到具有双35S启动子的AOC,ipt双基因转录融合的植物表达载体pGreenII0229-AOC-ipt。

bcr/abl融合转录子阳性的B细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型特点

为探讨B细胞型急性淋巴细胞白血病 (B ALL)中bcr/abl融合转录子阳性白血病细胞的生物学特征 ,用流式细胞术检测 2 6例bcr/abl阳性及 32例bcr/abl阴性B ALL病例的免疫表型 ,用PCR法检测免疫球蛋白重链(IgH)基因重排。结果表明 :所有的病例均为CD19阳性。bcr/abl阳性与bcr/abl阴性B ALL表面分子有显著统计学差异 (P <0 .0 5 )的是CD34(96 .2 %与 6 5 .6 % ) ,CD10 (96 .2 %与 71.8% )及CD38(43.8%与 95 .4 % )。在 2 6例bcr/abl阳性病例中 ,原始细胞共表达CD10 + /CD19+ /CD34+ ,CD10 + /CD34+ /HLA DR+ 和CD10 + /CD34+ /CD38-分别为 92 .3% (2 4 / 2 6 ) ,73 1% (19/ 2 6 )和 5 6 .2 % (9/ 16 )。对bcr/abl阳性组的 17例进行了IgH基因重排检测 ,10例阳性 (5 8.8% )。 14例bcr/abl阴性组中 12例 (85 .7% )阳性。在 32例bcr/abl阴性病例中 ,原始细胞共表达CD10 + /CD19+ /CD34+ 和CD10 + /CD34+ /HLA DR+ 分别为 4 3.8% (14 / 32 )和 37.5 % (12 / 32 ) ,无 1例表型为CD10 + /CD34+ /CD38-。结论 :bcr/abl阳性B ALL患者CD34和CD10阳性率较高 ,而CD38阳性率较低 ,且IgH基因重排检出率较低 ,其独特的免疫表型特征是CD10 + /CD34+ /CD38-。

初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子与临床关系的观察

目的 研究初发慢性髓系白血病bcr/abl融合基因转录子类型与临床关系。方法 使用RT PCR对 5 1例初发CML患者进行bcr/abl融合基因转录子检测。结果 b3a2型患者血小板数高于b2a2型患者 ,但b3a2型患者WBC数低于b2a2型患者 (P <0 .0 5 ) ;血红蛋白浓度与b2a2型患者比较无差异 (P >0 .0 5 ) ;b3a2型和b2a2型患者比较AKP和Ph1染色体比例无差异 (P >0 .0 5 ) ;M bcr/abl阳性患者伴m bcr/abl阳性率为 47 0 % ,其中b3a2型患者有m bcr/abl融合基因转录子 14例 ,b2a2型患者有 10例。结论 b3a2型CML患者初发时更易有血小板升高表现 ,但b2a2型患者更易有WBC数升高的表现 ,较多的初发CML患者同时伴有m bcr/abl阳性。

促纤维增生性小圆细胞肿瘤石蜡包埋组织中EWS-WT1融合转录子的检测

目的:探讨促纤维增生性小圆细胞肿瘤(DSRCT)石蜡包埋组织中EWS WT1融合基因表达的临床病理意义及其应用价值。方法:收集DSRCT石蜡包埋组织4例,原始神经外胚叶瘤/尤文肉瘤(PNET/ES) 2例,腺泡状横纹肌肉瘤2例,淋巴瘤2例,应用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测t( 11; 22 ) (p13;q12 )染色体易位融合基因EWS WT1的表达。结果: 4例DSRCT中有3例检测出融合基因的表达,对照组均没有检测出。结论:DSRCT石蜡包埋组织中检测EWS WT1融合基因的表达具有较好的敏感性和特异性,可作为临床病理诊断和鉴别诊断DSRCT的一个可靠的基因诊断指标。

建立实时荧光定量逆转录PCR方法检测非小细胞肺癌棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因

目的建立一种实时荧光定量逆转录PCR方法,对非小细胞肺癌间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因进行快速、敏感和特异检测。方法首先,应用Primer Premier 5.0软件,针对棘皮动物微管相关蛋白4(EML4)-ALK常见融合变异V1、V2、V3a和V3b设计引物和Taqman水解探针。然后,以包含EML4-ALK融合变异V1、V2、V3a和V3b的假病毒颗粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性和特异性。最后,用所建立的方法检测50例非小细胞肺癌临床标本,其中包含3例ALK-荧光原位杂交(FISH)(+)样本。结果在无背景RNA干扰情况下,建立的实时荧光定量逆转录PCR方法检测灵敏度高达10拷贝/!l。在500拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达1%,在5000拷贝/!l的野生型背景RNA下,其敏感性达0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞及血浆RNA为研究对象,均未见非特异性扩增。对50例非小细胞肺癌临床标本进行检测,47例阴性标本检测均为阴性,3例ALK-FISH(+)标本2例检测阳性,1例未检出,未检出原因与标本RNA提取失败有关。结论本研究建立的实时荧光定量逆转录PCR方法是一种快速、简便以及具有高灵敏度和特异性的EML4-ALK融合基因检测方法,值得在临床进一步验证和推广。