HPV16 E7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建HPV16 E7慢病毒表达载体。方法用RT-PCR方法从Caski细胞中扩增HPV16 E7基因的编码区序列,对扩增出目的片段酶切纯化后将目的片段交换连接入慢病毒表达质粒,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。Western-blot验证3FLAG-E7融合蛋白在293 T细胞中的表达。结果成功获得HPV16 E7基因,成功将HPV16 E7克隆到慢病毒表达质粒中,且包装产生的慢病毒颗粒能成功表达3FLAG-E7融合蛋白。结论成功构建HVP16 E7和flag基因共表达的慢病毒表达载体,为进一步研究HPV16 E7基因的功能建立了高效稳定的转基因技术平台。

逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

目的 研究HPV16E7(humanpapillomavirus 16E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞 ,检测HPV16E7基因的整合与表达 ,并用生长曲线、血清依赖试验 ,电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察 ,了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出了能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆 ,已传代 5 0代 ,PCR及RT PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录 ,转化细胞的生长速度要高于正常软骨细胞 ,二者都对血清有较大程度的依赖 ,转化细胞的核质比大 ,核仁明显 ,S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强 ,可连续传代达 5 0代。

HPV18E7重组质粒的构建及在大肠杆菌中的表达优化

目的构建HPV18E7基因重组质粒,并探索其在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法以提取的HeLa细胞株中的DNA为模板PCR扩增HPV18E7基因;将HPV18E7基因与载体pET-32a(+)连接为重组质粒pET-32a(+)-HPV18E7;将该重组质粒转入大肠杆菌BL21-DE3-pLysS细胞中,探索优化表达的条件,以获得大量HPV18E7致癌蛋白。结果 PCR扩增的目标基因大小序列与HeLa细胞中的HPV18E7基因的大小序列一致。用LB培养基,IPTG和乳糖诱导表达显示不同浓度、不同温度、不同诱导起始量等表达量均不高,尝试用ZYM-5052自动诱导培养基诱导,HPV18E7融合蛋白的表达量远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的表达量。结论测序正确的HPV18E7重组质粒在自动诱导培养基ZYM-5052中获得远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的HPV18E7融合蛋白。

HPV6E7介导TLR通路调控CA角质形成细胞凋亡、焦亡、增殖作用

目的:探讨HPV6E7基因介导TLR通路调控对尖锐湿疣(Condyloma acuminate,CA)角质形成细胞凋亡、焦亡和增殖的作用。方法:应用CRISPR/case9系统敲除Caspase-3和Caveolin-1基因。角质形成细胞(HaCaT细胞、HDF-a细胞)分组:分为Con组、sh HPV6E7组、HPV6E7OE组。TLR抑制剂Chloroquine干预,Re-al time PCR和Western blot定量检测角质形成细胞HPV6E7、TLR、焦亡标志性基因NLRP3 mRNA及蛋白。染色质免疫共沉淀(CHIP)检测角质形成细胞中HPV6E7与NLRP3结合。iTRAQ标记液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。功能性实验:(1)CCK-8检测细胞增殖;(2)FCM检测细胞凋亡。结果:Chloroquine干预后,sh HPV6E7组和HPV6E7OE组HPV6E7、TLR、NLRP3 mRNA及蛋白显著下调,sh HPV6E7和HPV6E7OE组增殖上升,凋亡率下降,差异有统计学意义(P<0.05)。CHIP验证HPV6E7与NLRP3直接结合。LC-MS/MS分析出43个显著差异蛋白质。结论:HPV6E7是引起尖锐湿疣发病的重要基因,Chloroquine干预对尖锐湿疣角质形成细胞凋亡、焦亡和增殖作用和影响显著。

腺病毒载体介导的HPV16E7基因沉默及其对宫颈癌CaSki细胞的影响

目的:构建利用RNA干扰技术沉默HPV16E7基因的腺病毒载体,并探讨其对人宫颈癌细胞系CaSki细胞增殖的影响,以及腺病毒载体在宫颈癌基因治疗中的可行性。方法:利用腺病毒载体介导的RNA干扰对CaSki细胞中HPV16E7蛋白的表达进行抑制。显微镜观察细胞病变情况。MTT实验用来检测腺病毒载体感染的CaSki细胞的增殖情况。结果:成功构建了用以介导CaSki细胞中HPV16E7基因沉默的腺病毒载体。腺病毒感染后的CaSki细胞发生典型病理变化,HPV16E7基因表达受到明显抑制,细胞分裂明显减慢。结论:腺病毒载体介导的RNA干扰能够特异性的沉默HPV16E7基因,抑制CaSki细胞的增殖,为腺病毒载体用于宫颈癌基因治疗的可行性提供了依据。

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。

免疫治疗药物ADXS-HPV的Ⅱ期临床研究获得新数据

Advaxis公司开发的免疫治疗药物ADXS．HPV可靶向作用于表达人乳头瘤病毒（HPV）基因E7的细胞，具有治疗因HPV感染而引起的宫颈癌的潜力。2012年10月27日，Advaxis公司的RobertPetit博士在癌症免疫治疗学会第27届年会上公布了其正在进行的一项Ⅱ期临床试验的最新数据。