HPV-58型感染的趾间尖锐湿疣1例

患者男,17岁。右足趾间菜花状增生物1月余。皮肤科情况:右足各趾间见数枚大小不等的菜花状增生物,部分浸渍糜烂。双足趾间皮肤浸渍、糜烂,部分脱屑,双足底皮肤片状脱屑。皮损组织病理示:角化过度,真表皮乳头瘤样增生,表皮颗粒层及棘层上部多量凹空细胞。采用聚合酶链式反应(PCR)检测皮损HPV分型:HPV-58阳性。局部皮肤真菌镜检:阳性。血HIV,TPPA,RPR检查均阴性。诊断:1.趾间尖锐湿疣(高危型);2.足癣。予CO_2激光治疗尖锐湿疣,同时予抗真菌治疗,2周后随访未见新发疣体,足癣皮损基本痊愈。目前仍在随访中。

持续感染状态的HPV-16及HPV-58亚型在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中的分布及意义

目的:研究呈持续感染状态的高危型人乳头瘤病毒(HPV-16,HPV-58)在宫颈病变患者中的分布情况及意义。方法:应用分子导流杂交技术分别检测10 477例慢性宫颈炎,3 672例宫颈上皮内瘤变,1 108例宫颈癌患者中呈持续感染状态的HPV-16和HPV-58的分布情况。结果:HPV-16持续性感染在慢性宫颈炎,CINⅠ,CINⅡ/Ⅲ中的阳性率依次为0.41%(95%CI,0.29%～0.53%),3.00%(95%CI,2.26%～3.74%),15.40%(95%CI,13.63%～17.17%),感染率呈逐渐升高趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV-58持续性感染在慢性宫颈炎,CINⅠ,CINⅡ/Ⅲ中的阳性率依次为0.56%(95%CI,0.42%～0.70%),2.66%(95%CI,2.36%～3.46%),6.92%(95%CI,5.68%～8.16%),感染率呈逐渐升高趋势,差异有统计学意义(P<0.01)。HPV-16持续性感染与宫颈癌各临床病理参数无明显联系,差异无统计学意义(P>0.05)。HPV-58持续性感染的宫颈癌患者发病年龄高于HPV-58机会性感染或未感染者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HPV-16及HPV-58持续性感染在宫颈癌前病变发生、发展过程中发挥重要作用,二者有望成为预测CIN进展的风险评估指标。高危型HPV亚型的定期检测对宫颈病变的预测和防治有重要的指导意义。

表达肿瘤抗原HPV-58E7的HLA-A^＊0201阳性宫颈癌细胞模型的构建和鉴定

为建立内源性表达58型人乳头瘤病毒(Huamn papillomavirus type 58,HPV-58)重要癌抗原E7蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型.以HPV-58全基因组为模板,采用PCR法扩增E7蛋白的编码基因,构建真核表达载体p EGFP-N2-HPV58E7;转化大肠杆菌DH5α,通过DNA测序鉴定质粒载体;经除内毒素纯化后,将大量制备的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用RT-PCR和细胞免疫荧光方法研究重组质粒在人源细胞中的表达情况;最后,选择HPV检出阴性的HLA-A*0201阳性人宫颈癌C33A细胞株为宿主细胞,采用脂质体转染、G418抗性加压筛选和细胞克隆化培养技术,建立能够稳定表达HPV-58 E7的恒定转染细胞株.采用RT-PCR、Western-blot和细胞增殖测定等方法从转录、翻译和表型等3个层次对所建细胞株进行鉴定研究.研究结果显示:克隆制备了HPV-58 E7蛋白的编码基因;构建获得了能够在人源细胞中表达HPV58E7-EGFP融合蛋白的真核表达质粒;并成功建立了能够稳定表达HPV-58 E7的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型;核酸和蛋白水平的鉴定结果表明所建模型细胞能够表达HPV-58 E7癌抗原,宿主细胞本身表达的Ⅰ类组织相容性抗原HLA-A*0201有望通过内源性抗原加工途径将E7抗原的细胞毒性T细胞(Cytotoxic lyphocyte,CTL)表位提呈到细胞表面;另外,细胞增殖试验结果亦表明该细胞模型体现出E7蛋白显著的诱导细胞增殖的生物学特征.总之,能够稳定表达HPV-58 E7癌蛋白的HLA-A*0201阳性人宫颈癌细胞模型的建立为后续即将展开的以HPV-58 E7为靶标的宫颈癌治疗性疫苗和药物的寻找和研究奠定基础.

HPV-58型E7蛋白抗原模拟表位的筛选及分析

利用该实验室成熟的噬菌体随机十二肽库筛选平台,对HPV-58型E7蛋白单克隆抗体株4C4a、6C7a进行3轮亲和筛选,得到2组、各8个阳性噬菌体克隆.阳性噬菌体氨基酸序列用以模拟单抗(靶蛋白)特异性识别的HPV-58型E7蛋白的抗原表位.将测得的阳性噬菌体多肽序列及HPV-58型E7蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析后,进行线性序列比对及构象性表位预测及分析.构象性表位的预测借力于Epi Search Server和Pepitope Server,对构象性表位匹配及簇的寻找提供有力支持,也为早期诊断及研制多肽疫苗提供参考.

分子伴侣促进截短型人乳头瘤病毒58亚型L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:采用分子伴侣pTf16共表达的形式促进截短型人乳头瘤病毒(HPV)58亚型L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:将重组表达质粒pGEX-6P-HPV58-L1转入含有分子伴侣pTf16的大肠杆菌BL21感受态细胞中,在2.0 mg/mL L-阿拉伯糖诱导表达20 min之后加入1.0 mmol/L的IPTG,18℃诱导表达24 h,使目的蛋白与伴侣蛋白共表达;重组蛋白经GST亲和纯化后去除GST标签免疫昆明鼠,ELISA检测免疫血清效价。结果:分子伴侣pTf16能显著提高目的蛋白的可溶性表达,经纯化及去除GST标签,用SDS-PAGE与Western印迹检测,约在相对分子质量50×103处出现特异性反应条带,该条带与截短型HPV58 L1蛋白预期大小相符,免疫动物后经ELISA检测小鼠血清的抗体效价为1∶6400。结论:获得了截短型HPV58 L1蛋白,动物免疫试验证实该蛋白具有较好的免疫原性,为进一步研制HPV58预防型疫苗奠定了基础。

58型人乳头瘤病毒L2蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体的制备

目的原核表达并纯化我国高发的致宫颈癌58型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)次要衣壳蛋白L2,并制备其单克隆抗体。方法从含有HPV-58基因组的质粒pHPV58中扩增L2基因,插入改构的原核表达载体pGEX-KGV中,转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达,透析复性并亲和层析纯化重组蛋白,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。结果重组表达质粒pGEX-KGV-HPV58 L2经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量可占菌体总蛋白的15.5%;纯化的重组蛋白纯度可达95%;共获得10株抗HPV-58 L2的高效价单克隆抗体。结论已成功原核表达、纯化了HPV-58 L2重组蛋白,并制备了单克隆抗体,为下一步HPV-58 L2蛋白抗原表位的研究以及相关预防性抗体药物和广谱重组疫苗的开发奠定了基础。

某市2109例女性宫颈细胞中HPV基因型别的研究

目的人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要致病原因。本文旨在探讨深圳市女性宫颈细胞中23种HPV感染的基因型分布情况。方法从深圳市妇幼保健院体检中心的2109例女性宫颈上皮细胞标本中提取23种HPVDNA,采用基因扩增及基因芯片技术对其宫颈细胞中的23种HPV基因型别进行检测,并对受检者的感染情况进行分析。结果 2109例女性宫颈上皮细胞标本中检出HPV感染者446例,总的HPV感染率为21.15%(446/2109),其中单一型别的阳性检出率为15.32%(323/2109);单一型别的感染中HPV52型为47例,其阳性检出率为2.23%(47/2109),其次是HPV43和58型均为38例,其阳性检出率均为1.80%(38/2109),是单一型别感染中最主要的型别。混合型HPV感染123例,其阳性检出率为5.83%(123/2109);其中HPV16+43、HPV16+58型各5例,均占混合型感染的4.07%(5/123),其次是HPV43+52、HPV43+56、HPV43+66型的二重感染各3例,均占混合型感染的2.44%(3/123),是混合型感染的主要型别。结论 HPV43、HPV52、HPV58单一型别及HPV16+43和HPV16+58型是感染深圳市女性宫颈细胞的主要基因型别,基因芯片检测技术可应用于宫颈细胞标本,一次可检测23种HPV基因型别,特异性强,敏感性高,对中国女性宫颈HPV感染基因型的分子流行病学的调查研究具有重要的意义。

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.

PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗的构建及真核表达

为构建和表达人乳头瘤病毒(HPV)58型相关宫颈癌治疗用疫苗,将HPV58mE6E7融合基因片段插入真核表达载体pCI-Fc-GPI中,构建重组真核表达质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。再将得到的sigHPV58mE6E7-Fc-GPI片段插入新型疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7中,构建PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗。经限制性内切酶鉴定及测序分析证实PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗构建成功。流式细胞术及免疫荧光检测表明该疫苗中的融合抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI及分子佐剂GM-CSF/B7.1能够同时实现真核表达。表明PVAX1-HPV58mE6E7FcGB复合基因疫苗可作为治疗HPV58相关肿瘤及其癌前病变的候选疫苗。

人乳头瘤病毒58 L1蛋白羧基端核定位信号在毕赤酵母细胞中的入核功能

目的研究人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58晚期蛋白1(L1)羧基端核定位信号在毕赤酵母细胞中的入核功能。方法分别构建全长HPV58L1基因和缺失羧基端核定位信号的HPV58L1基因与绿色荧光蛋白(Green fluores-cent protein,GFP)基因融合的重组表达质粒,在毕赤酵母中表达相应蛋白,用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在毕赤酵母细胞中的分布情况。结果融合基因表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;表达的融合蛋白没有聚集在毕赤酵母细胞核中,而是随机地分布在毕赤酵母细胞细胞核和细胞质中。结论 HPV58 L1蛋白的羧基端核定位信号在毕赤酵母细胞中不发挥主动入核的功能。