下调HPV16 E6/E7表达宫颈癌细胞Siha上清液代谢组学

目的 基于核磁共振氢谱(1H NMR)代谢组学筛选抑制HPV16 E6/E7表达,检测宫颈癌Siha细胞中差异代谢物以及相关通路,以明确感染高危型HPV16宫颈癌发生的关键代谢标志物。方法 通过RNAi片段转染Siha细胞下调E6/E7表达,分为正常对照组(Siha细胞)、空载组(si-NON)、si-E6组与si-E7组,并验证其转染效率。利用1H NMR代谢组学技术揭示干扰Siha细胞中E6/E7表达后所涉及的差异代谢物;结合MetaboAnalyst 5.0在线软件,得到改变的差异性代谢物和相关的代谢途径。结果 荧光倒置显微镜观察细胞荧光存在;Western blotting检测结果显示,与Siha组比较,si-E6组与si-E7组中E6/E7的表达量降低(F=145.8,P<0.001);下调E6/E7表达后,检测13种共有差异代谢物,包括异亮氨酸(Isoleucine),亮氨酸(Leucine),缬氨酸(Valine);MetaboAnalyst 5.0在线软件分析结果提示,以上代谢物主要涉及氨酰-tRNA生物化学合成途径;异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物化学合成途径;酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸的生物化学合成等10条代谢途径。结论 HPV16感染后通过改变葡萄糖及氨基酸相关代谢促进宫颈癌的进展,为宫颈癌的防治提供理论依据。

HPV16 E6 下调 DHRS2 表达可介导宫颈上皮细胞的致癌转化

目的探讨HPV16 E6对宫颈上皮细胞基因及信号通路的影响,筛选与致癌转化相关的基因。方法构建HPV16 E6感染的正常人宫颈上皮细胞(HUCEC)模型,进行转录组测序筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析差异信号通路。采用RT-qPCR验证主要差异下调表达基因。对主要差异基因的蛋白结构与HPV16 E6蛋白进行分子对接预测分析,通过RT-qPCR及Western blot验证HUCEC细胞模型中主要差异基因表达情况,并采用RT-qPCR及Western blot实验在宫颈癌细胞系SiHa及CaSki中进一步验证差异基因的表达。结果共筛选出差异表达2倍以上的基因55个。本研究聚焦下调差异基因,结果表明:负调控的差异基因GO功能富集于氧化还原过程;KEGG富集分析主要与碳水化合物代谢及癌症等相关。10个差异基因mRNA下调表达趋势与测序结果基本一致。分子对接预测DHRS2与HPV16 E6蛋白存在相互作用。与对照组比较,HUCEC细胞模型中HPV16 E6下调DHRS2的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)、ETV5的蛋白(P<0.01)表达;在SiHa、CaSki细胞系中,与对照组比较,DHRS2的mRNA及蛋白表达亦明显下调(P<0.05),并与P53蛋白表达趋势正相关。结论HPV16 E6可能通过下调DHRS2表达介导宫颈细胞致癌转化,促进宫颈癌发生。

HPV16 E6-295T/G和E6-350T/G变异位点影响IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白质表达的研究

目的探讨HPV16(Human Papillomavirus Type 16)E6-295T/G和E6-350T/G变异位点对IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白质表达的影响。方法在宫颈癌细胞C33A(HPV阴性)中分别转染真核表达载体295G/350G-GV230、295T/350G-GV230和295T/350T-GV230作为实验组,以NC-GV230作为对照组。通过免疫组织化学法、Western blot方法检测HPV16 E6295T/G、350T/G不同变异位点对IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白质表达的影响。通过IBM SPSS Statistics 26软件对实验结果进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义,免疫组织化学法定量采用image J软件进行阳性细胞计数。结果Western blot结果显示,免疫分子干扰素κ(Interferon Kappa,IFNκ)的表达,HPV16 E6-295G/350G变异组较HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G组降低(P<0.01,P<0.05)。HPV16 E6-295G/350G变异组的免疫分子主要组织相容性复合体I类(Major Histocompatibility Complex Class I,MHC-I)的表达显著低于HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G组(P<0.05)。HPV16 E6-295G/350G变异组的信号转导子和转录激活子1(Signal Transducer and Activator of Transcription 1,STAT1)表达显著低于HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G组(P<0.05,P<0.01)。变异组HPV16 E6-295G/350G与HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G变异组相比,干扰素调节因子9(Interferon Regulatory Factor 9,IRF9)表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论HPV16病毒E6蛋白质可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的蛋白质表达水平,E6基因T295G/T350G变异降低这些分子的表达作用最强。

β-D-葡聚糖通过下调HPV16 E6和重新激活p53调节HPV16阳性宫颈癌细胞的生物学行为

目的:研究β-D-葡聚糖在宫颈癌细胞中的作用及可能机制。方法:CCK-8法检测β-D-葡聚糖对宫颈癌细胞CaSki、HeLa和SiHa细胞增殖的影响,伤口愈合试验检测细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞中HPV16 E6/E7、HPV18 E6/E7、p53和p21 mRNA表达水平,Western blot检测N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、p53、波形蛋白、p21蛋白表达水平。以宫颈癌CaSki细胞为研究对象,在雌性BALB/c小鼠皮下注射成瘤,验证β-D-葡聚糖在体内对肿瘤生长的抑制作用。结果:β-D-葡聚糖对不同宫颈癌细胞增殖的影响不同,对CaSki细胞增殖有显著的时间依赖性抑制作用,对HeLa细胞增殖无显著影响,对SiHa细胞作用72h后表现为促进增殖作用(P<0.05)。β-D-葡聚糖对CaSki、HeLa和SiHa细胞的迁移都有抑制作用(P<0.05)。β-D-葡聚糖对CaSki、SiHa的细胞周期有调节作用并能促进其凋亡(P<0.05),但对HeLa细胞无显著影响。与对照组相比,β-D-葡聚糖处理组CaSki和HeLa细胞中HPV16 E6 mRNA表达水平降低,p53和p21 mRNA表达水平在3种细胞中均升高(P<0.05)。与对照组相比,β-D-葡聚糖处理组3种细胞波形蛋白表达量降低,E-钙黏蛋白、p53和p21表达量增加(P<0.05)。结论:β-D-葡聚糖抑制宫颈癌细胞中HPV16 E6表达并上调p53和p21表达,抑制HPV16阳性宫颈癌细胞的增殖、迁移,调节细胞周期,促进细胞凋亡,并在体内发挥抗肿瘤作用。

HPV16 E6基因变异通过调控BDNF/TrKB表达促进宫颈癌细胞增殖的研究

目的:明确人乳头瘤病毒E6(HPV16 E6)基因变异对宫颈癌细胞增殖影响的机制研究。方法:采用Real-time PCR检测宫颈癌组织及宫颈上皮内瘤样病变Ⅱ级(CINⅡ)宫颈组织样本中HPV16 E6 T350G、脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体B(TrKB)及肿瘤蛋白53(p53)mRNA的表达水平;设计并构建HPV16 E6 T350G慢病毒(pLV5-HPV16 E6 T350G)及空载体(pLV5-vector),转染人宫颈上皮细胞(HCerEpiC),Real-time PCR检测HPV16 E6 T350G、BDNF、TrKB及p53 mRNA表达水平,以及Western Blot检测BDNF和TrKB蛋白表达水平及磷脂酰肌醇3激酶/丝/苏氨酸激酶(PI3K/AKT)磷酸化水平;细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT)检测细胞增殖情况。结果:与CINII宫颈组织相比,宫颈癌组织中HPV16 E6 T350G、BDNF、TrKB mRNA表达水平均呈阳性,p53 mRNA表达呈阴性;在HCerEpiC细胞中过表达HPV16 E6 T350G后,可上调BDNF和TrKB蛋白与mRNA表达水平,以及激活BDNF/TrkB下游信号通路PI3K/AKT,并且减少p53蛋白表达水平;HPV16 E6 T350G过表达能够增强HCerEpiC细胞的增殖能力。结论:HPV16 E6 T350G过表达可促进宫颈癌细胞增殖能力,可能与上调BDNF/TrkB表达促进PI3K/AKT信号通路的活化进而降低p53表达有关。

RNA干涉抑制宫颈癌CaSki细胞株HPV16 E6基因的研究

背景与目的:研究表明宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)E6、E7癌基因密切相关,于是人们采用核酶或HPVE6、E7反义寡核苷酸抑制其表达来治疗宫颈癌,虽然取得了一定的效果,但仍面临基因抑制效率低、维持时间短、工作量大、耗费多等问题。本研究采用最新的RNA干扰技术干扰宫颈癌CaSki细胞中HPV16E6转录,以了解其能否特异性抑制HPV16E6基因及其时效性如何。方法:设计合成针对HPV16E6的荧光标记siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过荧光照片计数荧光细胞占所有细胞的比例计算转染效率;测定转染后不同时间点的细胞凋亡率;RT-PCR测定HPV16E6mRNA变化,Westernblot和流式细胞仪检测转染前后蛋白表达情况。结果:相差显微镜荧光照片显示细胞转染的效率为81%。HPV16E6siRNA转染细胞后24h、48h、5天凋亡率分别为7.7%、11.8%和37.4%,转染9天时凋亡率下降至12.6%。RT-PCR扩增结果显示,细胞转染前HPV16E6mRNA的量与siRNA阴性对照比较没有显著性差异,但转染后24h、48h、5天和9天分别减少了77%、83%、59%和41%;而作为内对照的β-actinmRNA在转染前后无变化。流式细胞仪定量测定HPV16E6蛋白,结果显示转染后24h、48h和5天,蛋白表达抑制率分别为79.7%、80.4%和71.3%;9天时抑制率有下降,但仍可达57.

新疆维、汉族宫颈鳞癌病变中HPV16 E6基因变异分析

目的分析新疆地区维、汉族妇女宫颈鳞癌组织中HPV16型E6基因的变异情况。方法从新疆地区5例维吾尔族妇女和5例汉族妇女宫颈活检组织中提取病毒基因组DNA,经反向膜杂交检测确定为HPV16单一感染。采用PCR技术扩增HPV16E6基因片段,克隆到pUC18-T载体中进行DNA测序。结果成功克隆了HPV16E6基因,DNA测序结果表明,与德国标准株相比,10例宫颈鳞癌组织中共检出12种E6基因突变类型,包括107(T→C)、133(A→C)、168(C→G)、178(T→G)、310(T→C)、321(T→C)、341(T→C)、350(T→G)、375(A→G)、410(T→A)、499(G→T)和548(A→G),其中178(T→G)和350(T→G)的突变频率较高,均为30%(3/10)。汉族和维吾尔族标本中共有的突变包括178(T→G)和350(T→G),仅存在于汉族标本的突变为107(T→C)、133(A→C)、168(C→G)、310(T→C)和499(G→T),仅发生在维吾尔族标本的突变为321(T→C)、341(T→C)、375(A→G)、410(T→A)和548(A→G)。结论与德国标准株比较,新疆维吾尔族、汉族宫颈癌患者中HPV16E6基因存在新的变异,其中178(T→G)和350(T→G)型基因变异为热点突变;新疆地区宫颈癌的高发可能与HPV16E6基因突变有关。

siRNA抑制鼻咽癌HNE-1细胞株HPV16 E6的表达和细胞增殖

目的:探讨小干扰RNA(Small interferirng RNA,siRNA)对鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)HNE-1细胞株HPV16E6基因表达的抑制作用,观察HPV16E6基因沉默对鼻咽癌细胞生长的影响。方法:体外合成4条针对HPV16E6基因的siRNA,通过脂质体转染导入鼻咽癌HNE-1细胞。用MTT检测转染后癌细胞的生长增殖情况,用半定量逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测转染后HPV16 E6 mRNA的表达水平,用免疫组化技术检测鼻咽癌细胞中HPV16 E6蛋白的表达水平。结果:导入有效siRNA后,MTT实验显示细胞的生长增殖受到明显抑制,抑制率可达32%;PT-PCR及免疫组化结果显示RNA干扰(RNA interfering,RNAi)可使HNE-1细胞中HPV16 E6 mRNA水平及蛋白表达水平下降。结论:siRNA可以有效抑制HNE-1细胞株中HPV16 E6的表达,降低鼻咽癌细胞的增殖能力。RNAi技术作为一种新的基因治疗技术在鼻咽癌治疗方面有着巨大的应用潜力。

HPV16 E6通过阻碍ING4对p53作用而抑制细胞凋亡的研究

通过HPV16 E6干扰ING4对p53作用的实验研究,探讨HPV16 E6新的致癌机制。采用转染及免疫共沉淀实验证明HPV16 E6阻碍ING4和p53结合及其诱导的p53蛋白乙酰化的作用;将表达p53、ING4和p53报告基因与HPV16 E6或其突变体的质粒共转染p53蛋白阴性的SaoS2细胞系,荧光素酶报告基因检测HPV16 E6抑制ING4对p53基因在转录水平的影响;并采用细胞集落形成实验检测HPV16 E6对ING4所诱导p53途径所致细胞凋亡的抑制。HPV16 E6阻碍ING4和p53结合及其诱导的p53蛋白Lys-382的乙酰化;HPV16 E6减弱ING4在转录水平对p53基因的调控,HPV16 E6抑制ING4诱导的p53途径介导的细胞凋亡,且所有这些作用不依赖p53蛋白的降解。HPV16 E6阻碍ING4对p53的作用而抑制细胞凋亡可能是其引起癌变的途径之一。

宫颈癌及癌前病变组织中Notch1及HPV16 E6/E7表达的研究

目的探讨Notch1受体和人乳头瘤病毒16感染在宫颈癌前病变和宫颈癌发生发展中的作用。方法采用免疫组化SP法检测18例宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和35例宫颈癌标本中Notch1受体及HPV16E6/E7蛋白的表达,以34例正常宫颈组织及慢性宫颈炎组织作为对照。比较各组间Notch1及HPV16E6/E7表达的差异,并分析Notch1与HPV16E6/E7表达的关系。结果Notch1蛋白在细胞胞浆、胞核及胞膜中表达,HPV16E6/E7在细胞核中表达。从对照组到CIN组到宫颈癌组,Notch1及HPV16E6/E7的表达均逐渐增强(P<0.01)。Notch1的阳性表达与宫颈癌不同分期、分化程度、淋巴结是否转移无关(P>0.05)。在宫颈癌组中Notch1与HPV16E6/E7的表达均呈正相关性(P<0.01)。结论Notch1表达与HPV16E6/E7感染可能与CIN及宫颈癌的发生密切相关,两者在宫颈癌的发病机制中可能协同发挥作用。

RNA干扰抑制HPV16 E6基因的表达对HPV16阳性宫颈癌细胞中基因表达谱的影响（英文）

目的:探讨RNAi抑制E6基因的表达对宫颈癌细胞基因表达谱的影响。方法:利用脂质体将已验证有效的表达针对E6基因小发卡RNA(shRNA)的重组质粒转染到宫颈癌细胞Ca SKi中,提取宫颈癌细胞总RNA并利用Agilent Human 1A寡核苷酸表达芯片检测RNAi后Ca SKi细胞基因表达谱的变化,最后实时PCR检测CDKN2B(p15)和MKI67来验证芯片分析结果。结果:与Ca SKi/PSN相比,共有2 765个基因表达有明显差异,其中有2 709个上调基因(包括代谢相关基因、肿瘤抑制基因、信号转导相关基因、凋亡基因等)和56个下调基因(包括原癌基因、DNA结合和转录基因、代谢相关基因、信号转导相关基因、细胞周期和发育相关基因等)。实时PCR结果表明CDKN2B(p15)和MKI67的变化与基因芯片分析结果一致。结论:联合应用RNAi和基因芯片分析技术可以为研究HPV16 E6与宿主细胞相互作用分子机制提够更丰富的资料和信息,并提供新的研究策略和途径。

HPV16 E6、P21^(WAF1)、CDK2、Livin在宫颈癌中的表达及其意义

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)16 E6、P21WAF1、CDK2、livin在宫颈癌中的表达及P21WAF1、CDK2、livin与E6的关系。方法采用免疫组化SP法检测HPV16 E6、P21 P21WAF1、CDK2、livin在20例宫颈癌、40例宫颈上皮内瘤变(CIN)及20例正常对照组中的表达。应用图像分析软件分别对此四个因子的表达进行平均光密度分析。结果E6、P21WAF1、CDK2、livin蛋白于宫颈癌组高于CIN1-2组及正常组(P<0.05),CIN3组高于CIN1-2组及正常组(P<0.05),宫颈癌组与CIN3组之间差异无统计学意义(P>0.05),CIN1-2组与正常组之间差异无统计学意义(P>0.05)。E6分别与P21WAF1、CDK2、livin成正相关(相关系数r分别为0.706、0.713、0.711,P<0.05)。结论E6、CDK2与宫颈癌的发生、发展密切相关,E6、CDK2异常高表达可能是宫颈疾病恶变早期事件。livin可能成为宫颈癌潜在的治疗分子靶向。

HPV16 E6 E7 siRNA作用于人宫颈癌细胞株的实验研究

HPV1摘6E要6、E7目原的癌:使基用因的HP特V异16性E6抑、E制7作siR用N,A为处探理讨表使达用HsPiRVN1A6阳治性疗宫的颈人癌宫的颈可鳞行癌性细提胞供株实Ca验Sk基i和础S。iH方a,法观:察分其别对设计并合成靶向于HPV16E6、E7的siRNA各3条,经脂质体包裹后转染两株细胞,分别采用RT-PCR和WesternBlot方s果iR:法N同A,通对组过照的对组靶转相基染比因前,表各后达E各水6、时平E7间则s无段iRN明两A显基均变因可化m引R。起N其A靶中及基蛋E因6白-表1的s达i表R水N达A平情和的况E显7的-著2检s性i测R下N,A验降对(证P靶R<0基N.0A因5i)作抑;而用制空的作脂特用质异较体性强组及。及时E6阴效-1性性si对。RN照结A和E7-2siRNA转染两株细胞后24h、48h、72h及96h均可观察到靶基因表达的显著性降低(P<0.05),而对相应的非靶基因无明显抑制作用。结论:不同序列的E6、E7siRNA,对靶基因的干扰效率不同;E6、E7siRNA分别作用于宫颈鳞癌细胞株,均引起了靶基因的特异、高效性的抑制,而对非靶基因的表达无明显变化,且抑制作用至少维持到转染后关9键6h词。为s进iR一NA步研E6究采E用7RHAPNV干16扰技宫术颈进癌行宫颈癌的生物治疗奠定了基础。

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。

HPV16 E6蛋白在宫颈癌中的作用研究进展

高危型人乳头状瘤病毒16型(HPV16)与50%以上的宫颈癌密切相关,其E6癌蛋白作为病毒生命周期的主要蛋白之一,在诱导肿瘤发生与发展进程中起重要作用,且与病毒复制、宿主细胞周期调控、细胞凋亡、细胞增殖、细胞恶性表型转化有关。E6蛋白主要作用包括:通过结合E6相关蛋白降解P53抑制细胞凋亡;增强端粒酶活性使宿主细胞永生化;与Daxx启动子区结合,抑制启动子转录活性,降低Daxx蛋白表达,阻遏细胞凋亡;与多种细胞因子相互作用后,经多种途径改变细胞微环境,使之有利于肿瘤细胞逃避宿主固有免疫应答。因此,在宫颈癌的发生和发展中,HPV16 E6蛋白通过多种作用机制发挥重要作用。

特异性siRNA抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6基因的表达

目的:研究RNAi技术抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16 E6癌基因的表达以及对细胞生物学特性的影响。方法:构建真核细胞表达特异性shRNA的pGENESIL-1/E6(PS6)重组质粒,脂质体转染细胞后用半定量RT-PCR技术检测CaSKi细胞中E6mRNA水平的变化,然后用western blotting检测RNA干扰前后p53和p21蛋白的表达来验证RNAi效应。用透射电子显微镜观察CaSKi/PS6细胞形态变化;应用流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化,最后利用细胞计数和裸鼠成瘤实验测定CaSKi/PS6细胞增殖能力。结果:成功构建了真核细胞表达特异性siRNA的PS6重组质粒;在RNA干扰24、48和72小时后CaSKi/PS6细胞中E6mRNA分别下降了21.50%、52.60%和65.60%;CaSKi/PS6细胞出现凋亡的特征性改变;RNA干扰24h、48h和72h后CaSKi/PS6细胞的凋亡率分别为27.94%、31.95%和56.63%,细胞生长周期停滞于S期。结论:应用RNA干扰技术能有效地、特异地抑制宫颈癌细胞中HPV16 E6基因的表达,为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制、临床治疗和干预性预防提供了新的方法。

RNA干扰HPV16 E6基因表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的:探讨HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法:利用化学合成的方法,合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染SiHa细胞。应用荧光定量RT-PCR和Western-blot检测HPV16 E6 mRNA及其蛋白水平的表达。MTT法绘制细胞生长曲线。流式细胞术评价HPV16 E6 siRNA对细胞周期的影响。结果:HPV16 E6 siRNA转染细胞48h及72h后,细胞内HPV16 E6 mRNA及蛋白表达量明显下调,与HPV16 E6阴性对照组及空白组比较[48h(1.85±0.15)vs(2.14±0.13),(2.29±0.11);72h(1.82±0.06)vs(2.32±0.14),(2.35±0.23)],差异有显著性意义(P<0.01);MTT显示细胞生长明显受到抑制;流式细胞术检测显示,E6 siRNA可将细胞阻滞在G1期。结论:HPV16 E6 siRNA能抑制SiHa细胞增殖。

重叠PCR合成HPV16 E6、E7基因并构建植物表达双元载体

HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗。通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐剂LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性。目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体。采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础。

HPV16 E6基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达HPV16 E6重组蛋白.利用自行构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6,经IPTG诱导表达HPV16 E6重组蛋白.实验结果表明,重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6在大肠杆菌中经IPTG诱导成功表达出HPV16 E6重组蛋白.HPV16E6重组蛋白的制备为宫颈组织中HPV16型感染的早期诊断和宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.

RNA干涉宫颈癌HPV16 E6基因的体内实验研究

目的:采用RNA干涉技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体内动物实验了解其抑制HPV16 E6基因的效率。方法:设计合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入动物腹腔或瘤体,通过移植瘤体积、重量的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化,肿瘤细胞凋亡来了解RNA干涉的效果。结果:体内实验中无论腹腔还是瘤内注射HPV16 E6 siRNA,均明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论:宫颈癌裸鼠移植瘤实验表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。