子宫颈上皮内瘤样病变和子宫颈癌组织中Smad2/3和HPV16 E7的表达及意义

背景与目的:Smads蛋白是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族信号转导的下游信号蛋白,与多种肿瘤的发生密切相关;人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是宫颈癌的重要致癌因素,但目前对两者在宫颈癌发病过程中相互关系的研究尚不充分。本研究拟检测不同宫颈病变组织中Smad2/3和HPV16E7蛋白的表达,探讨HPV感染和Smad2/3蛋白变化在宫颈癌形成和演进进程中的相互关系。方法:采用免疫组织化学SP法检测20例宫颈慢性炎症、30例宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和30例宫颈癌组织中Smad2/3和HPV16E7的表达情况,比较其在各种病变中表达水平的差异。结果:Smad2/3蛋白在慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌组织中的阳性率分别为50.0%、73.3%和93.3%,宫颈癌组分别与慢性宫颈炎组和CIN组比较,差异有统计学意义(P<0.05),慢性宫颈炎组与CINⅢ级组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16E7蛋白阳性率在慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌组织中分别为60.0%、66.7%和83.3%,各组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。Smad2/3阳性率与宫颈癌临床分期、病理类型、组织学分级和淋巴结转移无关(P>0.05)。Smad2/3与HPV16E7表达呈正相关(r=0.271,P=0.015)。结论:Smad2/3蛋白在宫颈癌组织中表达升高,可能在宫颈癌的发生过程中起重要作用;HPV感染与Smad2/3蛋白在宫颈癌组织中表达升高密切相关。

HPV16 E7和Brn-3a在宫颈癌前病变中的表达及其意义

目的研究HPV16E7和Brn3a在各级宫颈癌前病变(CIN)中的表达情况以及两者之间的关系,从分子生物学水平探讨其作为宫颈癌前病变的特异性标志物的可能性,以期寻找新的宫颈癌前病变筛查方法。方法对71例患者行宫颈薄层细胞学检查(ThinprepCellTest,TCT),并在阴道镜下组织学活检,其TCT残留标本,用RTPCR法检测各标本中HPV16E7和Brn3a的表达。结果HPV16E7和Brn3a表达按细胞学分级和病理学分级其阳性率呈逐级增高趋势,差异均有显著性(P<0.0001)。两者作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的诊断标志物,其结果是一致的(P<0.05)。结论TCT残留标本适合进行RTPCR分析研究。HPV16E7可作为宫颈癌前病变和HPV活化状态的生物标志物。Brn3a可作为可靠的CIN3生物标志物和HPV致癌基因转录活化的标志物。HPV16E7和Brn3a相互作用,可能为宫颈高度癌变发展的原因之一。

湖北地区HPV16 E7和E5基因突变与宫颈病变的相关性

目的分析湖北地区宫颈病变组织中HPV16E7和E5基因序列变异及该变异与宫颈病变的相关关系。方法对HPV16E7和E5DNA阳性的20例正常宫颈、30例CINⅠ~Ⅱ、30例CINⅢ和35例宫颈鳞癌的基因片段进行纯化测序,检测基因变异。结果除了HPV16E7和E5原型序列以外,HPV16E7最常见变异为A647G和T846C的联合变异株,该联合变异株频率在正常宫颈、CINⅠ~Ⅱ、CINⅢ和鳞癌组中突变率分别为25%、30%、53.3%、62.9%;HPV16E5最常见变异为A3979C＋A4042G联合变异株,联合变异株在正常宫颈、CINⅠ~Ⅱ、CINⅢ组和鳞癌组中突变率分别为30%、33.3%、56.7%、71.4%;HPV16E7和E5联合突变株在宫颈病变各阶段差异有统计学意义。结论 HPV16E7.A647G/T846C和HPV16E5.A4042G/A3979C联合变异株为中国湖北地区宫颈病变中流行的变异株,此变异株与宫颈病变程度呈正相关。

宫颈癌前病变中ΔNP63与HPV16 E7表达的研究

目的:研究宫颈上皮内瘤变中ANP63和HPV16 E7 mRNA的表达情况,寻找用于临床评估CIN病变进展趋势的生物学标志物。方法:收集临床71例薄层液基细胞标本,采用SP免疫组化法检测细胞中ANP63的蛋白表达,RT-PCR法检测残留标本中HPV16 E7的mRNA转录情况。结果:1．ANP63定位于异常鳞状上皮细胞和腺细胞,在CIN中表达高于炎症组(P< 0．05);2．HPV16 E7在CIN中表达明显高于炎症组(P<0．05);3．CIN中ANP63与HPV16 E7的检测结果具有较好的一致性。结论:ANP63可作为CIN的生物学标志物辅助细胞学筛查;ANP63可间接反映HPV16 E7的转录情况,有利于临床评估高危型病毒HPV16的致瘤能力。

针对HPV16 E7基因的RNA干扰对CaSKi细胞生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰抑制HPV16 E7基因对宫颈癌细胞系CaSKi细胞生物学特性的影响。方法:用脂质体将pGENESIL-1/E7(PS7)转染CaSKi细胞内,用透射电子显微镜观察细胞形态变化;细胞计数法测定细胞增殖能力的变化;流式细胞仪测定DNA含量来检测细胞是否发生特征性的凋亡;最后比较细胞裸鼠的成瘤能力。结果:透射电镜显示,凋亡细胞体积变小,细胞核染色质浓缩、趋边,细胞膜表面伪足消失,产生凋亡小体。流式细胞仪检测结果表明,RNA干扰24h、48h和72h后,CaSKi/PSN细胞的凋亡率分别为0.21%、0%、1.62%,CaSKi/PS7细胞的凋亡率分别为31.49%、28.95%、31.54%。生长周期停滞于S期;裸鼠荷瘤实验比较研究显示,RNA干扰后的CaSKi/PS7组的瘤结节体积、重量均较CaSKi/PSN瘤细胞显著降低(P<0.05),CaSKi/PS7组的平均抑瘤率为55.4%。结论:本研究为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制、临床治疗、信息分子药物的开发和干预性预防提供了新的资料和方法。

短发夹状RNA抑制子宫颈癌CaSki细胞HPV16 E7基因的研究

目的:研究短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)构建的人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16 E7 siRNA表达载体转染宫颈癌细胞株CaSki细胞后,在体内外对CaSki细胞E7基因的抑制作用。方法:利用脂质体将构建有HPV16 E7特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的表达载体P1、P2、P3转染CaSki细胞,以实时荧光定量RT- PCR及流式细胞仪检测不同时间点E7 mRNA和蛋白的变化,并将载体P1转染后的细胞接种到裸鼠皮下,4周后观察裸鼠体内皮下移植瘤体积和质量的差异,并用免疫组化检测瘤体组织中E7蛋白的表达变化。结果:表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7 mRNA和蛋白的表达。其中载体P1抑制作用最强,在抗性克隆形成后1周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92．86%、84．21%;在抗性克隆形成后4周,抑制率仍分别为68．95%、62．50%。在接种后4周载体P1组裸鼠体内皮下移植瘤的体积和重量明显小于空载体组和对照组,同时E7蛋白的表达也被有效抑制,抑制率为74．75%。结论:构建有shRNA的E7 siRNA表达载体在体内外可明显抑制E7基因的表达。

结直肠癌组织HPV16 E7 DNA及蛋白表达的研究

目的 分析不同部位、分期的结直肠癌及正常黏膜组织中人乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16型E7的表达状况。方法 应用PCR及免疫组化方法检测82例手术切除的结直肠癌新鲜标本及距肿瘤近端10 cm以远的正常黏膜组织中HPV16 E7 DNA及蛋白的表达。结果 结直肠癌组织HPV16 E7 DNA表达阳性率为51.22%(42/82),明显高于正常黏膜组织的4.88%(4/82),P<0.01; 直肠癌组织中HPV16 E7 DNA表达阳性率为64.10%(25/39),明显高于升结肠癌的18. 18%(2/11), P<0. 05; HPV16 E7 DNA表达阳性率与Dukes分期有关(P<0.01),与癌组织分化程度无关。免疫组化染色显示,HPV16 E7蛋白主要为细胞核表达,胞浆也可见少量表达,进一步确认了HPV16的感染,且HPV16 E7蛋白与HPV16 E7 基因的表达具有相关性,免疫组化敏感性较PCR方法为低。结论 结直肠癌组织HPV16 E7 DNA及蛋白的表达阳性率明显高于正常黏膜组织,提示部分结直肠癌存在HPV16感染。癌灶部位距肛门越近,感染率越高; Dukes分期越晚感染率越高。

HPV16 E7通过调控miR-29a-CDK6信号通路促进肿瘤细胞增殖

目的探究人乳头瘤病毒16 E7(HPV16 E7)通过调控细胞内miR-29a表达促进细胞增殖的分子机制,从miRNA的视角探讨高危型HPV的致癌机制。方法将HPV16 E7基因构建到真核表达载体pcDNA3.1(-),将重组质粒及空载质粒分别转染人前列腺癌细胞PC3;通过半定量RT-PCR检测细胞周期相关基因及miR-29a潜在靶基因CDK6、HBP1的表达水平,通过荧光素酶报告实验确定miR-29a的靶基因;将miR-29a mimic及inhibitor分别瞬时转染PC3-E7和PC3-3.1细胞,Western blot检测CDK6蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期分布。结果与对照组相比,克隆细胞株PC3-E7中CDK4、CDK6、Cyclin E2、E2F1等细胞周期相关调节因子及miR-29a的潜在靶基因HBP1、CDK6等表达均有不同程度的上调(均P<0.01);而PC3-E7细胞中CDK6蛋白表达水平亦明显高于对照组(P<0.01);miR-29a通过靶向3′-UTR区域调控CDK6基因转录和蛋白表达,E7高表达后下调了miR-29a的表达水平,使得CDK6表达升高,而加速细胞周期G;期向S期进展。上调miR-29a后可以抑制CDK6的表达,并调控下游细胞周期,部分逆转E7的促增殖效应。结论miR-29a与CDK6 mRNA 3′UTR结合并下调其表达,从而抑制细胞的增殖,E7-miR-29a-CDK6信号通路可能是高危型HPV致细胞发生恶性增殖的重要途径。

特异性siRNA抑制宫颈癌细胞中HPV16 E7基因的表达

目的:用真核表达siRNA干扰技术特异性抑制宫颈癌细胞CaSKi中HPV16E7癌基因的表达。方法:运用DNA重组技术构建表达特异性siRNA的pGenesil-1/E7(PS7)重组质粒,用脂质体分别将重组质粒转染宫颈癌细胞系CaSKi细胞内,通过半定量RT-PCR实验检测CaSKi/PS7细胞中E7mRNA水平的变化;再用western blotting检测CaSKi/PS7细胞中E7蛋白、磷酸化pRb和去磷酸化Rb的表达;用免疫细胞化学法检测细胞中ki-67、NF-κB、bcl-2和p16的表达。结果:成功构建了真核细胞表达的、特异性siRNA的PSN和PS7重组质粒。在RNA干扰24、48和72小时后CaSKi/PS7细胞中E7mRNA分别下降了21.05%、51.80%和49.10%;RNA干扰后的CaSKi/PS7细胞中E7蛋白的表达逐渐减低,而且磷酸化pRb表达降低和去磷酸化Rb的表达升高;与CaSKi/PSN细胞相比,CaSKi/PS7细胞中的ki-67、NF-κB和bcl-2表达降低,而p16的表达增加。结论:本研究成功构建了真核细胞体内表达特异性siRNA重组体,有效地抑制了宫颈癌细胞CaSKi中HPV16E7基因的表达,为RNA干扰应用于研究宫颈癌发病分子机制提供了新的资料和方法。

p16^(INK4A)和HPV16 E7/HPV18 E6在ASCUS中的表达及临床意义

目的:探讨p16 INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6在宫颈细胞学诊断为非典型性鳞状细胞不明确意义型(ASCUS)中的表达及筛查潜在宫颈病变的价值。方法:对150例ASCUS患者行阴道镜检查并取活检,同时对该150例患者的TCT标本进行免疫细胞化学染色检测p16INK4A的表达和RT-PCR法检测其中HPV16型E7蛋白和18型E6蛋白(HPV16 E7/HPV18 E6)mRNA的表达。结果:p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA在ASCUS中表达的阳性率分别为37.33%和46.67%,随着病理级别的增加,p16INK4A和HPV16E7/HPV18 E6 mRNA表达的阳性率也随之增加;p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA筛查ASCUS中宫颈病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为0.88、0.95、0.91、0.93和0.81、0.75、0.67、0.86,在p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA阳性的样本中,宫颈病变发生率分别为91.07%和67.14%,均明显高于阴性样本中的发病率7.45%和13.75%(P<0.001);ASCUS中宫颈病变样本中p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA呈高表达,且具有较高的一致性(κ=0.6475)。结论:p16INK4A和HPV16 E7/HPV18 E6 mRNA在ASCUS中病理诊断为宫颈病变的样本中均呈高表达,对筛查潜在的宫颈病变具有重要意义,其中p16INK4A的筛查效能优于HPV16E7/HPV18E6mRNA;p16INK4A能间接反映HPV的转录活性,在ASCUS的分流中有重要意义,且可视性的p16INK4A免疫染色比HPV检测更直观。

子宫颈上皮内瘤变及鳞状细胞癌组织cyclin D1的表达特征及与HPV16 E7的相关性

目的探讨细胞周期蛋白D1(cyclin D1)在子宫颈上皮内瘤变(CIN)及鳞状细胞癌中的表达及其与人乳头状瘤病毒(HPV)16 E7的关系。方法选择2013-09—2015-09内蒙古自治区赤峰学院医学院附属医院经病理确诊为子宫颈上皮内瘤和宫颈鳞癌的患者以及同期宫颈正常上皮人群作为研究对象,取其子宫颈组织制成石蜡标本。其中子宫颈上皮内瘤81例,宫颈鳞癌40例,宫颈正常上皮50例。采用即时荧光定量PCR、免疫组织化学法检测cyclin D1在三组细胞组织中的基因以及蛋白的表达情况;采用逆转录PCR、Western blot、免疫组织化学法检测cyclin D1在不同E7表达状态的的三组细胞中的表达情况。结果正常宫颈组织组cyclin D1表达均为阳性,CIN组和鳞状细胞组只有少数表达为阳性,显著少于正常宫颈组织组,且随着宫颈上皮内瘤变等级的升高cyclin D1表达量逐渐降低;E7基因在正常宫颈组织中不表达或微表达,在CIN组以及鳞状细胞癌组表达更高,以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论子宫颈癌的发生受多重因素影响,HPV感染是该症发生的主要因素。随着宫颈上皮内瘤变等级的升高cyclin D1表达量逐渐降低,且E7基因的高度表达是导致cyclin D1低表达的主要原因。

HPV16 E786-93纳米颗粒疫苗的免疫杀伤效果研究

目的:研究人乳头瘤病毒16型(HPV16)E786-93CTL表位肽与免疫佐剂CpG-ODN自组装纳米颗粒疫苗在肿瘤模型中的免疫效果。方法:化学合成HPV16 E786-93CTL表位肽,与CpG-ODN通过静电相互作用自我组装形成纳米颗粒,采用透射电镜、动态光散射等方法鉴定纳米颗粒的性质;构建治疗性肿瘤动物模型,观察纳米颗粒疫苗在动物模型体内的抗瘤效应;通过流式细胞术测定瘤内浸润性T细胞比例、外周血及脾脏内T细胞比例;体外培养小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC),测定经纳米颗粒刺激的BMDC培养上清中的IL-6和IL-12p40浓度。结果:构建了直径约210 nm大小均匀的纳米颗粒,该纳米颗粒疫苗能显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长,且对于小鼠瘤内浸润性T淋巴细胞及脾脏内、外周血中的T淋巴细胞比例均有提升,同时能在体外有效刺激BMDC分泌细胞因子。结论:HPV16E786-93CTL表位肽联合CpG-ODN自组装纳米颗粒疫苗能有效杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤增长,改善体内免疫微环境。

HPV16 E7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建HPV16 E7慢病毒表达载体。方法用RT-PCR方法从Caski细胞中扩增HPV16 E7基因的编码区序列,对扩增出目的片段酶切纯化后将目的片段交换连接入慢病毒表达质粒,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。Western-blot验证3FLAG-E7融合蛋白在293 T细胞中的表达。结果成功获得HPV16 E7基因,成功将HPV16 E7克隆到慢病毒表达质粒中,且包装产生的慢病毒颗粒能成功表达3FLAG-E7融合蛋白。结论成功构建HVP16 E7和flag基因共表达的慢病毒表达载体,为进一步研究HPV16 E7基因的功能建立了高效稳定的转基因技术平台。

HPV16 E7对A431细胞中Smad7表达的影响

目的研究HPV16 E7对A431表皮鳞癌细胞Smad7表达的影响,并分析其潜在的意义。方法应用基因工程技术转染并筛选出稳定表达HPV16 E7的A431细胞,采用qRT-PCR、Western blotting及激光共聚焦技术,观察并比较转染前后A431细胞中Smad7的表达。结果 A431细胞中Smad7的表达强度随转染HPV16 E7后时间的延长而升高(P<0.05)。Smad7蛋白的亚细胞定位,存在胞浆向胞核移位的现象。结论稳定高表达HPV16 E7后的A431细胞中Smad7表达水平升高,并可以影响Smad7的细胞定位。

HPV16、HPV16 E7蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的作用

目的观察HPV16及其早期区基因E7表达蛋白与Rb蛋白在喉癌发生中的相关性,为探索喉癌的病因学提供依据。方法用免疫组织化学方法检测82例喉鳞癌、39例非癌组织标本中HPV16、HPV16 E7以及Rb的蛋白表达。结果HPV16 E7和Rb蛋白表达的阳性率在非癌及癌组织中有非常显著的差异(P<0.01),HPV16的阳性率在非癌及癌组织中有显著性差异(P<0.05)。喉癌组织中,Rb蛋白在HPV16和HPV16 E7阳性及阴性组中的阳性率显著不同(P<0.01),而在非癌组织中则无此现象(P>0.05)。结论喉癌组织中HPV16 E7的高表达导致的pRb功能失活是引起喉癌的主要原因之一。

子宫颈鳞状细胞癌中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表达及病理学分析

目的探讨子宫颈鳞状细胞癌中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7的表达及病理学情况。方法分析2013年2月～2015年4月浙江省湖州市德清县中医院病理科收集的手术切除宫颈新鲜标本90例的病理学情况,依据宫颈病变分级标准进行分组：正常组（20例）、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ组（20例）、CINⅡ组（15例）、CINⅢ组（15例）、宫颈鳞癌组（20例）。采用免疫组化法检测Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白表达情况;观察并比较Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈不同病变、临床分期、病理情况的宫颈组织中的表达;观察Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白与宫颈鳞癌病理分期的相关性。结果鳞癌组Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于正常组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。Ⅱa～Ⅱb期宫颈鳞癌组织中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于Ⅰa～Ⅰb期宫颈鳞癌组织,低分化宫颈鳞癌组织中Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均高于高分化、中分化宫颈鳞癌组织,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白阳性表达率均与宫颈鳞癌病理分期呈正相关（r=0.305、0.306、0.304,均P〈0.05）。结论 Aurora-A、MCM7和HPV16 E7蛋白在宫颈癌、癌前病变中具有重要的意义,各蛋白联合检测可以为宫颈癌诊断及预后评价提供可靠的理论依据。

下调HPV16 E6/E7表达宫颈癌细胞Siha上清液代谢组学

目的 基于核磁共振氢谱(1H NMR)代谢组学筛选抑制HPV16 E6/E7表达,检测宫颈癌Siha细胞中差异代谢物以及相关通路,以明确感染高危型HPV16宫颈癌发生的关键代谢标志物。方法 通过RNAi片段转染Siha细胞下调E6/E7表达,分为正常对照组(Siha细胞)、空载组(si-NON)、si-E6组与si-E7组,并验证其转染效率。利用1H NMR代谢组学技术揭示干扰Siha细胞中E6/E7表达后所涉及的差异代谢物;结合MetaboAnalyst 5.0在线软件,得到改变的差异性代谢物和相关的代谢途径。结果 荧光倒置显微镜观察细胞荧光存在;Western blotting检测结果显示,与Siha组比较,si-E6组与si-E7组中E6/E7的表达量降低(F=145.8,P<0.001);下调E6/E7表达后,检测13种共有差异代谢物,包括异亮氨酸(Isoleucine),亮氨酸(Leucine),缬氨酸(Valine);MetaboAnalyst 5.0在线软件分析结果提示,以上代谢物主要涉及氨酰-tRNA生物化学合成途径;异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的生物化学合成途径;酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸的生物化学合成等10条代谢途径。结论 HPV16感染后通过改变葡萄糖及氨基酸相关代谢促进宫颈癌的进展,为宫颈癌的防治提供理论依据。

表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建表达HPV16E7基因的重组腺病毒质粒.方法设计携带酶切位点和无酶切位点的两对引物以扩增ccdBKan目的片段.分别将ccdBKan与质粒pBR322-Ad4-eGFP共转至电转感受态GB08red-gyr462构建两种表达ccdBKan基因的重组Ad4质粒.利用ccdB正反筛选系统与ExoCET/Red重组结合将HPV16E7基因插入Ad4的E1A区,构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒pBR322-Ad4-E 1 Amut-C16E7P,经酶切、测序验证.提取质粒pBR322-Ad4-EIAmut-C 16E7P释放基因组,转染293T细胞以包装和扩增病毒,用病毒感染293T细胞,检测HPV16E7基因在细胞内的转录水平和蛋白表达.重组病毒经肌肉接种BALB/C裸鼠,收集小鼠血清用于病毒中和实验.结果成功构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒,并在293T细胞中成功包装出重组病毒.qRT-PCR和Western blotting验证了重组病毒HPV16 E7基因的成功表达,病毒中和实验结果提示经重组病毒免疫后的小鼠血清能够中和Ad4-HPV16E7.结论成功构建了表达HPV16E7基因的重组腺病毒株,为进一步研究HPV16 E7在癌症发病机制中的作用以及HPV感染相关癌症的治疗方法提供新的思路和依据,并且可能为HPV治疗性疫苗的研究探索提供了一种潜在策略.

人乳头瘤病毒16型E7基因靶向调控cGAS-STING信号通路抑制宫颈癌细胞免疫功能的研究

目的:探讨HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路对宫颈癌细胞免疫功能的影响。方法:体外构建HPV16 E7过表达和干扰质粒,转染至SiHa细胞,qPCR检测HPV16 E7 mRNA表达水平,流式细胞术检测CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。在此基础上分别转染cGAS-siRNA和STING-siRNA至SiHa细胞,CCK8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。qPCR和Western blot分别检测cGAS、STING、IFN-Ⅰ、HPV16 E7的mRNA及蛋白表达。流式细胞术检测细胞CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。结果:STING-siRNA+HPV16 E7过表达组CD95和MICA/B水平降低(P<0.05),CD73、CD39、CTLA-4和CD25水平升高(P<0.05)。cGAS、STING和IFN-Ⅰ蛋白表达水平降低(P<0.05)。STINGsiRNA+HPV16 E7干扰组结果与之相反。结论:HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路进而抑制宫颈癌细胞免疫功能。

纳米雄黄混悬液诱导Siha细胞凋亡及对HPV16E6/E7表达的影响

目的：探讨纳米雄黄混悬液对人宫颈癌Siha细胞的抑制增殖、诱导凋亡作用及其对HPV16E6和E7致瘤基因的影响。方法：采用微射流法制备纳米雄黄混悬液,应用不同质量浓度（6.25,12.5,25,50 mg.L^-1）的纳米雄黄混悬液作用于Siha细胞不同时间（12,24,48,72 h）,光镜和透射电镜观察实验组（不同质量浓度的纳米雄黄混悬液处理组）和对照组（不加药物的细胞）细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA Ladder形成;MTT比色法测定细胞生长抑制情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期改变;RT-PCR方法检测HPV16E6和E7的表达。结果：纳米雄黄混悬液25~50 mg.L-1处理Siha细胞48,72 h后,细胞存活率降低,凋亡增加,作用呈时间-剂量依赖关系。电镜显示细胞呈典型的凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞DNA Ladder形成;流式细胞术检测证实细胞凋亡率与纳米雄黄混悬液作用浓度呈明显相关,与对照组相比,差异有极显著意义（P〈0.01）,且细胞呈G0-G1期阻滞。RT-PCR检测显示随着纳米雄黄混悬液作用浓度的增加,HPV16E6和E7的表达不同程度地受到抑制。结论：纳米雄黄混悬液对于Siha细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用,其机制可能与其抑制HPV16E6和E7致瘤基因的表达有关。