型特异性、构象依赖性HPV16 L1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:研制具有型特异性和构象依赖性的人乳头瘤病毒16主衣壳L1蛋白(HPV16 L1)单克隆抗体(mAb)。方法:利用昆虫-杆状病毒系统表达有生物活性的HPV16 L1蛋白。非变性条件下纯化HPV16 L1蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。非变性Western blot鉴定mAb的型特异性和构象依赖性,细胞免疫组化确定抗体的型特异性。间接ELISA法测定杂交瘤分泌上清及腹水中抗体效价。mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类。结果:获得1株稳定分泌具有型特异性和构象依赖性的HPV16 L1抗体的杂交瘤细胞株,命名为2E3。2E3杂交瘤细胞株细胞培养上清中抗体效价为1∶800;小鼠腹水中抗体效价为1∶12800。亚类鉴定结果为IgG1κ。Western blot及细胞免疫组化分析结果显示,2E3mAb具有型特异性和构象依赖性,只与非变性的HPV16L1蛋白发生反应,不与HPV18L1、HPV58L1、HPV11L1产生交叉反应。结论:成功制备了型特异性HPV16 L1 mAb,为进一步研究HPV16 L1的抗原表位奠定了基础。

HPV16 L1蛋白在原核表达系统中的表达与纯化

目的 建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法 ,纯化目的蛋白。方法 构建pGEX4T HPV16L1表达质粒。在大肠杆菌BL2 1表达系统中表达 ,经过包涵体提取 ,8mol/L尿素溶解 ,分级透析除去尿素 ,亲和层析进行提纯。结果 HPV16L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在 ,通过本方法可以获得纯化的蛋白。结论 建立了一套纯化HPV16L1蛋白的方法。

重组HPV16 L1衣壳蛋白的表达与层析纯化工艺的优化

在大肠杆菌系统中表达重组HPV16 L1衣壳蛋白,并采用实验设计(design of experiments,DOE)对重组蛋白的阳离子交换层析纯化工艺参数进行优化,以获得更高的回收率,为产品生产提供指导。首先,构建表达载体pET-30a-16 L1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,进行诱导表达并应用50 L发酵罐高密度培养工程菌;然后,单因素变量筛选4种阳离子交换层析介质,DOE方法优化上样流速及缓冲液的pH,疏水层析进一步纯化;分析重组HPV16 L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的蛋白纯度、回收率、内毒素、宿主残余蛋白和残余DNA,并进行透射电镜形态观察;最后,HPV16 L1 VLPs免疫小鼠,评价体内所诱导的中和抗体水平。结果显示,筛选并确定pH为8.0的缓冲体系和5 mL/min的上样流速进行POROS^(TM)XS阳离子层析作为蛋白纯化条件,疏水层析进一步纯化;纯化后蛋白浓度为1.0 mg/mL,回收率为46.23%,纯度为97%,内毒素含量小于12.5 EU/mL,宿主残余蛋白为6.00 ng/mL,宿主残余DNA为3.30 ng/mL;小鼠免疫6周后血清的中和抗体滴度Log10平均值为4.01。本研究利用大肠杆菌表达系统成功表达HPV16 VLPs,获得优化后的阳离子交换层析纯化工艺,为VLPs疫苗的研发提供了思路,为DOE在生物工程领域的应用提供依据。

利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP两种抗原在检测宫颈癌抗 16L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别 ,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长15 35bp的HPV16L1基因片段 ,克隆至 pUC18 T载体中 ,进行DNA测序鉴定。然后 ,将HPV16L1基因克隆至pGEX 2T表达载体中 ,并诱导表达HPV16L1融合蛋白 ,分子量为 83kD ,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经GST柱层析法纯化后 ,与重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP分别经酶联免疫吸附 (ELISA)法检测 12份宫颈癌患者和 35份献血员血清。 12例宫颈癌血清标本中 ,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为 7例 (占 5 8.3% ) ;抗HPV16L1 VLP的抗体阳性率为 8例 (占 6 6 .7% )。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG(+)的 7份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测均阳性 ;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG( )的 5份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测有 1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异 (P >0 .0 5 )。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关 ,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1 VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16L1对宫颈癌的抗体进行定性。

宫颈癌组织中HPV16L1蛋白质的表达及意义

为探讨人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白表达与宫颈癌发生与发展的关系,为防治宫颈癌奠定基础。采用收集宫颈癌患者48例、宫颈上皮内瘤样病变(cervcal intraepithelial neoplasia,CIN)患者41例和慢性宫颈炎患者30例石蜡组织标本用于免疫组织化学实验的方法。检测HPV16 L1蛋白在宫颈癌组织、CIN组织和慢性宫颈炎组织中的蛋白质表达状况。HPV16 L1蛋白质免疫组织化学实验的结果显示,慢性宫颈炎组织中阳性率为100%,而在宫颈癌组织中阳性率仅为27.1%,差异有统计学意义(P<0.01)。慢性宫颈炎组织的阳性率明显高于宫颈癌组织。由此可知,HPV16 L1蛋白质在宫颈原位癌开始表达减少,宫颈浸润癌表达减少更明显,可能可以用于诊断CINⅡ和CINⅢ或CINⅡ和宫颈癌。

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 HPV16L1重组蛋白的表达为研制HPV16L1预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 pPIC3 5 HPV16L1 GS115阳性菌株 ,经 0 5 %甲醇诱导 ,运用SDS PAGE电泳检测L1蛋白 ;用鼠抗HPV16L1单克隆抗体 ,经WesternBlotting检测蛋白的特异性 ;在透射电镜下观察类病毒颗粒 (VLPs)。结果 SDS PAGE检测结果表明 ,在5 5KD处有诱导蛋白带的出现 ;经WesternBlotting验证 ,该蛋白能与HPV16L1单克隆抗体特异结合 ,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白 ;电镜下见到了直径约为 5 0nm、形态结构与天然病毒颗粒极其相似的VLPs。结论 pAIC3 5 HPV16L1重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HPV16L1晚期蛋白 ,该蛋白在酵母菌中可自我组装成VLPs。

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法，从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段，采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法，将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体，构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ，Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１，回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段，利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点，产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段，将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ，构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒，ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ，释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段，定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体，成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ。

HPV16主要衣壳蛋白L1在昆虫细胞中的表达及免疫学活性分析

目的 在昆虫细胞中表达HPV16L1(m2 0 2 )蛋白 ,并分析其免疫学活性。方法 构建表达载体pFASTBACHTb L1(m2 0 2 ) ,用重组病毒感染sf9细胞表达HPV16L1(m2 0 2 )蛋白 ,SDS PAGE、western blot鉴定其表达 ,亲和层析和离子交换层析纯化后的产物经鼻腔免疫Balb/c小鼠 ,竞争抑制ELISA分析免疫血清的中和活性。结果 SDS PAGE、western blot结果证明HPV16L1(m2 0 2 )蛋白的表达 ,纯化复性后产率约为 17% ,免疫血清具有竞争抑制HPV中和单抗与HPV16L1(m2 0 2 )相结合的能力。结论 昆虫细胞表达的HPV16L1(m2 0 2 )

HPV16L1VLP纯化、鉴定及血凝抑制实验方法的建立

摘要通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达HPV16L1 VLP,纯化鉴定后利用其建立血凝抑制实验,检测HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。利用重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞表达HPV16L1蛋白,大量获得VLP;优化扩增蛋白的条件并用SDS-PAGE分析鉴定;经氯化铯密度梯度离心法纯化VLP;利用所得VLP建立血凝抑制试验,鉴定制备的HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。优化蛋白表达条件结果显示,当重组杆状病毒感染细胞的MOI=10时目的蛋白表达量最大;按此滴度感染悬浮培养的昆虫细胞,收获、纯化VLP并鉴定其特异性;利用所得VLP建立了血凝抑制实验,鉴定HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制效价为1∶16。建立的血凝实验,可用于鉴定和检测HPV16L1相关抗体,为HPV诊断试剂的开发提供实验基础。

THE CONSTRUCTION OF HPV16-L1 RECOMBINANT PLASMID AND ITS EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS

Infection with high risk human papillomavirus is regarded as the major risk factor in the development of cervical cancer. In this study, HPV16 L1 eukaryotic expression plasmids pcDNA LI were constructed, which were transfected into mammalian cells Cos 7. The expression of HPV16 L1 in transfected cells were identified by in situ hybridization, immunospot and immunocytochemistry. HPV16 L1 mRNA transcription and L1 protein expression were found in recombinant plasmid transfected cells. This expression system will provide us with plentiful resource for HPV16 L1 immunological study and will be helpful for the design of HPV16 prophylactic vaccine.

rBCG-HPV16L1-E7疫苗的构建和免疫原性研究

[目的]构建以BCG为载体的rBCG-HPV16L1-E7疫苗,研究rBCG-HPV16L1-E7重组表达体嵌合乳头状瘤病毒样颗粒(VLPs)对小鼠免疫功能的影响,初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤(宫颈癌)的预防作用。[方法]电穿孔法将pIJ702-HPV16L1-E7分泌型穿梭表达质粒导入BCG中表达,构成rBCG-HPV16L1-E7疫苗。Western blot检测E7蛋白的表达。采用rBCG-HPV16L1-E7疫苗皮下注射于C57BL/6小鼠,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性(cytotoxic T lymphocyte,CTL),ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体和细胞因子的表达水平。[结果]Western blot法分析证实,该重组疫苗能特异地表达HPV16 E7蛋白。以rBCG-HPV16L1-E7免疫小鼠后,检测到的细胞因子IL-2、IFNγ及E7抗体的含量明显升高,诱导机体产生特异的抗体反应以及CTL反应。[结论]rBCG-HPV16L1-E7能增强小鼠的细胞和体液免疫反应,可作为HPV16预防性疫苗。

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1在原核细胞的表达及免疫效果观察

目的：人乳头瘤病毒16型（HPV16）疫苗的研制可望防治宫颈癌的发生、发展，本实验从中国感染人群中克隆L1基因，期望制备中国人群的HPV16的预防性疫苗。方法：从HPV16阳性的尖锐湿疣临床标本中，PCR扩增HPV16L1基因，克隆、测序，并在原核细胞表达L1蛋白，纯化蛋白经过复性后，电镜观察病毒样颗粒（VLP），VLP免疫动物观察抗体产生情况。结果：克隆的HPV16L1，测序结果发现有4个特异性突变位点是nt6240的C-G、nt6432 A→G、nt6901-03及nt6951-53。将HPV16L1基因克隆到原核表达载体pET-28a（＋），高表达的蛋白应用蛋白转印证实是HPV16L1蛋白，纯化的蛋白复性后可以自组装VLP，免疫动物产生高滴度的抗体。结论：从临床标本克隆表达了HPVl6L1基因，可以在原核细胞高表达及体外组装VLP，并且具有良好的免疫原性。为研制HPV16预防性疫苗探索一条易于推广而经济的制备途径。

HPV_(16)L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640+10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。

鲍温氏病组织人乳头瘤病毒16型结构基因L1的克隆及其序列分析

本研究采用 ＰＣＲ法从中国妇女鲍温氏病（Ｂｏｗｅｎ＇ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）组织标本扩增获得了与宫颈癌密切相关的人乳头 瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）的晚期基因Ｌ１，并装入测序载体测序分析了其ＤＮＡ的序列，与标准型进行了比较，发现有 若干变异。此研究对序列及变异意义进行了分析和讨论，为今后Ｌ１基因分子流行病学调查、Ｌ１蛋白的结构与功能研 究、疫苗研制以及ＨＰＶ相关的基础性研究提供了有用的资料。同时在国内外首次报道了鲍温氏病组织中ＨＰＶ１６Ｌ１的 序列及其变异情况，并在ＧｅｎＢａｎｋ［１］申请到序列号（ＡＦ０８９５２）。

女性外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的相关性

目的研究外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的关系。方法收集西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的44例女性外阴病变患者的临床病理资料,包括鳞癌11例,鳞状上皮内瘤变(VIN)10例,尖锐湿疣9例及白色病变14例。采用免疫组化SP方法检测HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白的表达。结果①4组外阴病变患者年龄中位数依次为:外阴鳞癌61岁、VIN 45.5岁、尖锐湿疣24岁、外阴白色病44岁,尖锐湿疣组中位年龄低于外阴鳞癌组及白色病变组(P<0.05),其余各组间中位年龄无统计学差异。②HPV16/18E6蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组及外阴鳞癌组的阳性率分别为2/14、3/9、3/10、8/11,外阴鳞癌组高于白色病变组(P<0.05),其余各组间无统计学差异;HPV6L1蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组、外阴鳞癌组的阳性率分别为1/14、8/9、4/10、3/11,尖锐湿疣组高于其他各外阴病变组(P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义。③HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白在早期外阴鳞癌的阳性率均高于中晚期(P<0.05);HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白表达均与外阴鳞癌的组织学分级、年龄分组、绝经情况、产次不相关(P>0.05);HPV16/18E6蛋白与HPV6L1蛋白在外阴鳞癌中的表达不相关(P>0.05)。结论外阴病变的发病与年龄及HPV16/18、HPV6感染有关;外阴鳞癌中HPV16/18、HPV6的感染率与FIGO分期有关,HPV16/18感染率与HPV6的感染率无关。

人乳头瘤病毒16型晚期基因L1的原核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建人类乳头瘤病毒 (HPV) 16型晚期基因 L1的原核表达质粒 ,以期从中选出能够高效表达 HPV16 L1的重组子 ,为进一步表达 L1蛋白奠定基础。方法 应用定向克隆策略 ,将 HPV16 L1基因分别克隆到原核表达载体 p Trac99A和 p ET- 2 1c中。结果 通过酶切鉴定选出了重组子 p Trc99A- HPV16 L1和 p ET- 2 1c-HPV16 L1。结论 HPV16

基于抗原表位分析的人乳头瘤病毒16L1壳蛋白基因克隆及表达纯化

目的：选择人乳头瘤病毒（HPV）16L1抗原性最强的一段抗原表位编码区,构建原核表达载体并利用大肠杆菌表达抗原蛋白,为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。方法：借助DNAstar软件分析HPV16L1的CDS区,选择抗原性最强的一段抗原表位编码区,提取HPV16L1编码区的DNA。目的 DNA和p ET32a质粒分别进行双酶切,连接并转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆后转化BL21大肠杆菌,诱导产生HPV16L1重组蛋白,通过市售抗体对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定。结果：利用DNAstar软件,选择了抗原表位较富集的碱基序列919~1314bp区段,按常规制备重组蛋白的方法成功制备HPV16L1重组蛋白。抗体鉴定表明,制备的重组蛋白抗原特异性良好。结论：有针对性地制备HPV16L1重组蛋白,可避免其他抗原表位的干扰。经鉴定,HPV16L1重组蛋白抗原特异性良好,将为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。