HPV16型DNA在大肠腺癌组织中表达的研究

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交技术，检测５０例大肠腺癌、３８例大肠腺瘤和２０例正常大肠粘膜组织的ＨＰＶ１６型ＤＮＡ序列。结果显示：三组病人ＨＰＶ１６型ＤＮＡ阳性率依次为４２％、３１．６％和０。大肠腺癌和腺瘤分别与正常大肠粘膜组织比较，ＨＰＶ１６型ＤＮＡ阳性率有显著差异（Ｐ＜０．０５）；大肠腺癌和腺瘤之间比较ＨＰＶ１６型ＤＮＡ阳性率无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。但ＨＰＶ１６型ＤＮＡ阳性的１２例大肠腺癌组织均伴组织细胞异型增生。结果表明：ＨＰＶ１６型与国人的大肠腺癌有关。

结直肠癌HPV16型感染和Ag-NOR的关系及预后价值

目的 探讨结直肠癌 HPV16型感染和 Ag- NOR的关系及预后价值。方法 应用多聚酶链反应 (PCR)和 Southern blot检测 5 0例结直肠癌 HPV16型 DNA序列和应用胶质银染技术检测其核仁组成区嗜银蛋白 (Ag-NOR) ,并结合临床随访和病理学资料评估其相互关系和预后价值。结果 结直肠癌组 Ag- NOR平均计数 (8.10±2 .5 8)明显高于正常结直肠粘膜组 (1.6 9± 0 .2 3) ;结直肠癌不同病理分期或分化程度比较 ,Ag- NOR计数差异均有显著性 (P<0 .0 5 ) ;Ag- NOR计数≥ 8与 <8的结直肠癌患者 Kaplan- Meier生存曲线比较 ,差异有显著性 (P<0 .0 0 1)。结直肠癌 HPV16型 DNA阳性者 Ag- NOR计数 (10 .2 7± 2 .0 8)明显高于 HPV16型 DNA阴性者 (6 .49±1.5 4) (P<0 .0 5 )。两者 5年生存率分别为 14.3%和 5 3.9% ,差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ;两者 Kaplan- Meier生存曲线比较 ,差异有显著性 (P<0 .0 0 1)。结论 Ag- NOR计数和 HPV16型 DNA可作为评价结直肠癌预后的参考指标。

HPV16型感染者宫颈组织p16、Ki-67表达及早期干预的对比研究

目的通过对HPV16型感染且无宫颈细胞学异常者行p16、Ki-67蛋白的表达检测,确定观察和早期干预治疗者,对p16、Ki-67蛋白表达者行早期干预治疗,以期延缓甚至阻断宫颈癌前病变到宫颈癌的进程。方法选取2015年12月~2017年5月江苏省常熟市中医院妇科门诊及住院患者中宫颈细胞学检查正常及人乳头状瘤病毒(humanpa pillomavirus,HPV)分型检测为高危HPV16型感染者122例作为研究对象,按宫颈组织p16、Ki-67蛋白的表达有无将其分为无表达组(A组)48例及表达组(B组37例和C组37例)74例,无表达组HPV16型感染者宫颈活检后观察一年,再行HPV分型检测+宫颈活检;表达组HPV16型感染者分为两组,一组行药物治疗(B组),一组行LEEP术治疗(C组),两组宫颈活检一年后均再行HPV分型检测+宫颈活检。结果p16、Ki-67蛋白表达的LEEP术治疗组(C组)CIN病变发生率比药物治疗组(B组)CIN病变的发生率低(0.00%vs24.32%),差异有统计学意义(P<0.05),药物治疗组(B组)CIN病变发生率低于p16、Ki-67蛋白无表达观察组(A组)CIN病变的发生率(24.32%vs37.50%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论对HPV16型感染者行宫颈组织p16及Ki-67免疫组化检查,有利于对p16、Ki-67蛋白表达组感染者行早期干预治疗,p16、Ki-67蛋白无表达观察组一年后有CIN病变的发生,也应给予密切随访,适时干预治疗,以防止病情进展,使得宫颈上皮内瘤变成为可预防和可控制的宫颈疾病。

HPV16 E5多表位肽免疫原性研究

目的筛选人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白多表位肽段,并评估其诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫的免疫原性反应。方法通过Uniprot获得HPV16 E5蛋白的氨基酸序列,采用EXPASY和SYFPEITHI等软件预测HPV16 E5蛋白的表位,筛选出富含B细胞和CTL表位的氨基酸肽段——HPV16 E5蛋白N端处aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV),进一步用该多表位肽免疫C57BL/6小鼠,评估其诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫的反应。结果该肽段可诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体,且抗体滴度随着免疫次数增加而升高,同时可诱导小鼠产生特异性的CTL反应,在效靶比为40∶1时,对靶细胞产生显著的特异性杀伤作用。结论HPV16 E5蛋白多表位肽aa28-46(LIRPLLLSVSTYTSLIILV)具有良好的免疫原性,可为基于HPV16 E5蛋白的疫苗研究提供基础。

表达HPV16型结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的 构建表达人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法 采用聚合酶链反应技术 (PCR)扩增并克隆HPV16主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2基因 ;将经过结构修饰的L1和L2基因插入痘苗病毒表达载体 ,通过与痘苗病毒在宿主细胞中同源重组后 ,筛选共表达L1 L2蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果 DNA序列分析证实PCR扩增所获L1和L2克隆基因是正确的 ;斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1和L2基因插入 ;该重组病毒在人源细胞中不复制或低水平复制 ,但可稳定表达相对分子质量为 5 70 0 0的L1蛋白和相对分子质量为 90 0 0 0的L2蛋白。结论 获得 1株稳定表达HPV16L1 L2蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。

HPV16型E6蛋白单克隆抗体制备及检测

目的制备人乳头瘤状病毒(human papillomavirus,HPV)16型E6蛋白单克隆抗体并对其进行检测。方法 15只Balb-c小鼠分为3组,各5只。设计3条HPV16E6抗原多肽分别对3组小鼠进行免疫,筛选得到对B细胞表位有较高活性的线性多肽HPE601,并用该组的小鼠脾脏制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA法对小鼠血清进行阳性克隆筛选和检测抗体效价,采用考马斯亮蓝染色鉴定抗体纯度,采用标准曲线计算抗体浓度,采用Western blot法检测并采用间接免疫荧光法验证纯化E6抗体对Caski、Hela和正常宫颈上皮细胞核蛋白特异性结合情况。行宫颈组织活检患者20例,其中HPV16型宫颈组织7例,HPV18型宫颈组织6例和正常宫颈组织7例,采用免疫荧光法检测单克隆抗体对3种组织的检出率。结果制备得到单克隆抗体Whu001,经鉴定抗体纯度较好,该克隆能特异性识别HPV16型E6蛋白;Whu001对HPV16型组织的检出率(80%)明显高于HPV18型宫颈组织(15%)和正常宫颈组织(0),差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功筛选出了针对HPV16E6抗原的单克隆抗体,其对HPV16的诊断具有特异性,为在蛋白水平上检测HPV E6蛋白提供了新途径。

HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位预测及分析

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨膜趋势及其亲水性,表面可及性,抗原性,极性和柔韧性等特性。综合以上参数预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位,并进一步进行同源性匹配分析。结果综合多个参数分析显示B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、30-36、45-49、105-109、119-125和148-158区段及其附近,进一步同源性匹配分析支持其中区段2-7、9-19、119-125及148-158为可能的B细胞线性表位,其中区段148-158(RSSRTRRETQL)为HPV16型E6蛋白所特有的序列,而区段2-7(HQKRTA)、9-19(FQDPQERPRKL)与HPV9型E6蛋白具有同源性,区段119-125(PEEKQRH)与HPV31型E6蛋白具有同源性。结论综合分析预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、119-125及148-158区段,为HPV16型E6蛋白的进一步研究奠定了基础。

HPV16/18型病毒感染与宫颈上皮类瘤样变、宫颈癌关系的研究

目的探讨高危型人乳头瘤病毒16/18型感染与宫颈上皮类瘤样变(CIN)及宫颈癌的关系。方法荧光定量PCR、薄层液基细胞学技术(TCT)同时检测6 412例宫颈拭子标本,观察薄层液基细胞学技术中正常及炎症组、CIN组、宫颈癌三组中HPV16/18型的感染率,及各组中HPV-DNA病毒含量的水平变化。结果正常及炎症组中HPV16型感染率2.6%(166/6 325),HPV18型感染率1.1%(69/6 325),总感染率3.7%(235/6 325),CIN组中HPV16型感染率24.67%(19/77),HPV18型感染率10.39%(8/77),总感染率35.06%(27/77),宫颈癌组中HPV16型感染率50%(5/10),HPV18型感染率10%(1/10),总感染率60%(6/10)。结论HPV16、HPV18型病毒感染与宫颈癌、宫颈上皮类瘤样变关系密切,荧光定量PCR、薄层液基细胞学技术同时检测可以早期发现早期治疗,是预防宫颈癌的有效手段。

2006至2008年英德市HPV16、18型病毒感染现状分析

目的对2006年至2008年英德市HPV(人乳头瘤病毒)16、18型病毒感染现状进行分析,探讨HPV16、18型病毒的各年度、各年龄组感染情况。方法荧光定量PCR检测6412例宫颈拭子标本,观察各年度、各年龄组中HPV16、18型病毒的感染率。结果HPV16、18型病毒三年的感染率分别为3.14%、3.67%、5.54%,总体感染率呈上升趋势,其中HPV16型的感染且呈现年轻化趋势。在6412例被检标本中,HPV16型阳性患者190例,感染率为2.9%,其中20～35年龄组阳性率2.5%(71/2817);36～49年龄组阳性率3.2%(100/3109);50以上年龄组阳性率为3.9%(19/486);HPV18型阳性患者78例,感染率为1.2%,20～35年龄组阳性率1.17%(33/2817);36～49年龄组阳性率1.09%(34/3109);50以上年龄组阳性率为1.02%(5/486);在英德地区HPV16型的感染率大于HPV18型的感染率。结论在宫颈癌的筛查中,荧光定量PCR检测HPV16、18型病毒感染结合巴氏染色检查、病理检查、阴道镜及临床检查,筛选出高危人群,定期复查,积极治疗,对宫颈癌的发生率、病死率的降低有很好的作用。

HPV16/18型原位杂交检测在子宫颈液基细胞学中的应用价值

目的:评价薄层液基细胞学及HPV16/18型原位分子杂交检测在子宫颈病变中的应用价值。方法:应用薄层液基细胞学技术及HE染色对112例患者行子宫颈脱落细胞学检查,按照TBS(theBethesda report system)细胞学分类标准分类:无上皮内病变或恶性病变(negative for introepithelia or ma-lignancy,NILM),意义不明确的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cell of undetermined significance,ASC-US)、低度鳞状上皮内病变(Low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、高度鳞状上皮内病变(High-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL),鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)。同时应用原位分子杂交方法对样本进行HPV16/18型检测。结果:①在112例细胞涂片中,NILM:16例(14.3%);炎症病变:26例(23.2%);ASC-US:44例(39.3%);LSIL:25例(22.3%);HSIL:1例(0.89%);②112例细胞涂片中HPV16/18型阳性率随着子宫颈病变加重而增高,NILM及炎症、ASC-US、LSIL及HSIL各组间相比,NILM及炎症病变组与LSIL及HSIL组之间表达差异有统计学意义(P<0.05);③对5例细胞学HPV16/18型胞浆阳性病例的子宫颈活检标本进行HPV原位杂交对照检查,结果显示细胞核均呈阳性。结论:子宫颈液基细胞学联合HPV16/18型原位分子杂交检测有助于发现HPV感染引起的子宫颈病变;HPV16/18型细胞涂片中胞浆阳性染色,可作为细胞学检查HPV阳性的判定指标。

游离型HPV16细胞类型特异性增强子片段的变异对启动子活性的影响

目的 研究宫颈癌中游离型HPV16中细胞特异性增强子（cell-type specific enhancer,CTSE）片段的变异对启动子P97活性的影响,探讨CTSE片段变异与游离型HPV16致癌机制的关系.方法 分别构建含HPV16突变型及野生型CTSE片段的重组报道基因载体（pCAT3-Promoter）表达系统,利用脂质体将重组的报道基因载体转染HeLa细胞;ELISA法测定细胞中CAT蛋白表达量的变化,了解变异CTSE片段对启动子活性的影响.结果 与无增强子的CAT报道质粒pCAT3-Promoter相比,插入HPV16 CTSE序列的pCAT3-Promoter重组报道质粒CAT蛋白表达量增加1.5 ～2.5倍;插入突变型CTSE序列的报道载体与插入野生型CTSE序列的报道载体相比,报道基因CAT蛋白表达量增加了约1.6倍.结论 陕西地区宫颈癌组织中HPV16 YY1位点突变的CTSE序列可激活启动子活性,YY1位点的突变与游离型HPV16 DNA致宫颈癌有密切关系.

精液人乳头瘤病毒(HPV)16型的检测在优生优育中的应用研究

人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ），能引起生殖道感染和先天感染。本研究采用ＰＣＲ方法，选用引物特异性地扩增ＨＰＶ１６型基因组的１９５ｂｐ的片段，对５０例精液进行了ＨＰＶ１６型的检测。结果显示：人群中阳性率２２％，其中正常生育组２０％，不育或有流产史组２２％。本研究为人群中精液ＨＰＶ１６型的流行病学提供了可参考的数据。

HPV16/18型病毒感染与宫颈癌的关系探讨

目的:研究探讨HPV16/18型病毒感染与宫颈癌的相互关系,分析其临床应用价值。方法:抽取我院2014年9月至2015年9月间收治的经病理诊断确诊为宫颈癌患者81例作为研究对象,并选择同期收治的198例宫颈炎症患者作为对照,分别提取两组患者宫颈分泌物中的DNA样品,实施PCR扩增,通过实时荧光定量PCR分析对HPV16/18DNA载量进行测定,计算并比较两组患者的检测阳性率。结果:宫颈癌患者和宫颈炎症患者的HPV16/18DNA载量对数值分别为(7.34±4.62)和(4.51±3.03),阳性率分别为79.01%和27.27%,均有宫颈癌患者显著高于宫颈炎症患者的情况,比较有统计学差异(P<0.05)。结论:宫颈癌与HPV感染之间存在显著相关性,且高危型HPV16\18感染是病变发生的必要条件,高病毒载量在宫颈癌的发展中有重要作用,通过早期发现、早期治疗,做好对高危人群的筛查,是宫颈癌的预防治疗的重要途径。

聚焦超声技术用于宫颈感染HPV16、18转阴治疗的临床研究

目的 探讨超短聚焦超声技术对宫颈感染HPV16、18转阴治疗的可行性。方法 选取我院门诊自,HPV-DNA检测示有16和(或)18(+),病理提示低级别鳞状上皮内病变(LSIL)及以下者共110例,随机分入HIFU(聚焦超声)组(n=41)、LEEP组(n=39)、药物组(n=30)进行治疗,观察治疗后并发症的情况及治疗后6、12个月HPV转阴情况。结果 HIFU组和LEEP组转阴率高于药物组,差异有统计学意义(P<0.05)。HIFU组和LEEP组间差异无统计学意义(P=0.065>0.05)。Normal组和宫颈炎组转阴率高于LSIL组,差异有统计学意义(P<0.001),Normal和宫颈炎组转阴率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。HPV-mRNA阳性组无论采取哪种治疗方式,转阴率均低于阴性组,差异有统计学意义(P<0.01)。HIFU组治疗后并发症发生明显低于LEEP组,创面愈合时间短于LEEP组(P<0.05)。结论 利于病毒清除HPV转阴,同时自内向外的治疗,保留了组织完整,并发症低,对于育龄女性尤其有生育要求的女性,作为高危HPV感染的治疗方式更值得推荐。

人乳头瘤病毒16型E_6基因的T-A克隆及在真核细胞中的表达

由于ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白能诱导机体保护性免疫反应，可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了ＨＰＶ１６Ｅ６基因工程蛋白，拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用ＰＣＲ技术从ＨＰＶ１６基因组中扩增获得转化基因Ｅ６的完整ＯＲＦ，按ＴＡ策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３Ｔ尾载体中，置于杆状病毒ＡｃＭＮＰＶＰｏｌｈ晚期启动子控制之下，用此重组转移质粒ｐＶＬ１３９３Ｅ６与杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６蛋白基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达为非融合性Ｅ６蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析其分子量约为１８ｋＤ，免疫印迹实验表明，此重组蛋白能被兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体所识别。

宫颈癌人类乳头状瘤病毒16/18型感染及增殖细胞核抗原表达的意义

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，近年来发病率有升高趋势。宫颈人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus。HPV）感染是宫颈癌的主要危险因素，高达90％以上的患者伴有HPV感染。HPV16型、18型的感染与宫颈鳞癌直接相关，在83．3％f10宫颈鳞癌组织中，可检测到HPV16、HPV18的DNA。

人乳头瘤病毒16型感染与机体免疫

宫颈癌是第一个被世界卫生组织认为100％与感染有关的癌症．人乳头瘤病毒16型（human papillomaviruses type16，HPV16）是与宫颈癌相关的最常见的HPV型别。据国际癌症研究中心（IARC）统计，宫颈癌标本中，HPV16型感染占51．0％。HPV宫颈感染常见于年轻、性活跃的妇女，这种感染大多是短暂的，并且不引起临床症状。感染妇女中70％～90％在12—30个月内自然清除感染，仅少数为持续性感染．

基于阴道微生态对比研究宫颈HPV16与HPV52单一亚型感染特征

目的对比分析宫颈人乳头瘤病毒(HPV)16与52单一亚型感染阴道微生态特征,探讨HPV16与52单一亚型阳性患者阴道微生态差异的临床意义,探求治疗不同亚型HPV感染的方法。方法将2020年2月至2023年1月在遂宁市第一人民医院妇产科门诊常规宫颈癌筛查的女性(20~65岁)作为研究对象,纳入符合标准的HPV16型、HPV52型、HPV阴性研究对象各165例作为参试者,HPV16、52型均为单一亚型感染,HPV阴性组作为对照组,3组参试者一般资料对比差异无统计学意义(P<0.05)。3组研究对象均行HPV分型、液基薄层细胞学(TCT)、阴道微生态检测,对比分析3组参试者阴道微生态相关指标(pH、过氧化氢、唾液酸苷酶、白细胞酯酶、葡萄糖醛酸酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、白细胞、杆菌、球菌、线索细胞、滴虫、清洁度)以及TCT情况。结果(1)3组参试者的阴道内pH情况,HPV16型组(5.01±0.31)显著高于HPV52型组(4.71±0.42)(F=56.26,P<0.05),也较对照组(4.68±0.43)明显异常(F=47.10,P<0.05);而HPV52型组阴道内pH与对照组比较差异无统计学意义(F=0.12,P>0.05)。(2)HPV16型组参试者阴道内白细胞酯酶、阴道微生态、TCT、pH>4.5异常人数较HPV52型组、对照组显著增多,差异均有统计学意义(均P<0.05),但是HPV52型组参试者阴道内白细胞酯酶、pH>4.5异常人数较对照组无明显增加,差异均无统计学意义(均P>0.05);而HPV16型组参试者阴道内过氧化氢、葡萄糖醛酸酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、清洁度、白细胞、杆菌较HPV52型组差异均无统计学意义(均P>0.05),但是2组均较对照组明显异常,差异均有统计学意义(均P<0.05);3组参试者阴道内唾液酸苷酶、球菌、线索细胞、滴虫比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论无论是HPV16型还是52型患者均存在阴道微生态失衡,HPV16型患者较52型更易出现微生态失调和子宫颈上皮内病变,可能与其阴道内较高pH有关,调节pH可能是治疗高危型HPV16型的一个方向,但可能并不适用于HPV52型,治疗HPV52型患者需要寻找新的思路。