浸润性宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中HPV16-E7蛋白和端粒酶的表达及意义

目的探讨16型人乳头瘤病毒E7(HPV16-E7)蛋白和端粒酶在浸润性宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达以及在宫颈癌发生、发展过程中的作用。方法30例浸润性宫颈癌(ICC组);90例宫颈上皮内瘤变(CIN),其中CINⅠ(CINⅠ组)30例,CINⅡ(CINⅡ组)30例,CINⅢ(CINⅢ组)30例。采用免疫组化Elivision二步法检测各组组织标本中HPV16-E7蛋白和端粒酶的表达。另设10例正常宫颈组织标本作为对照组。结果对照组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和ICC组中的HPV16-E7蛋白阳性表达率分别为30.0%、63.3%、63.3%、76.7%和96.7%,ICC组和CINⅢ组显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);而ICC组与CINⅢ组比较,CINⅢ组与CINⅡ组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。对照组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ组和ICC组的端粒酶阳性表达率分别为30.0%、40.0%、43.3%、70.0%和93.3%,ICC组显著高于CINⅢ组,CINⅢ显著高于CINⅡ组,差异均有统计学意义(均P<0.05);而CINⅡ组与CINⅠ组比较,CINⅠ组与对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。浸润性宫颈癌及宫颈上皮内瘤变患者的HPV16-E7蛋白与端粒酶的表达呈正相关(r=0.376,P<0.01)。结论HPV16-E7蛋白和端粒酶的表达与宫颈癌的发生、发展有关。

宫颈鳞状细胞癌及尖锐湿疣中HPV 16-E6、HPV16-E7蛋白的表达

使用免疫组化方法检测HPV16-E6、HPV16-E7蛋白在宫颈鳞状细胞癌及宫颈尖锐湿疣、外阴尖锐湿疣的情况，结果显示宫颈鳞状细胞癌、宫颈尖锐湿疣及外阴尖锐湿疣中HPV16-E6蛋白的表达分别为50％、0％、0％；HPV16-E7蛋白的表达分别为78.3％、68.4％、85.3％。宫颈鳞状细胞癌及尖锐湿疣中均有HPV16-E7蛋白表达，但同时发现低危型HPV感染中也表达HPV16-E7蛋白，原因尚须进一步研究。

HPV16-E7在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

本研究利用酵母Pichia pastoris真核表达系统表达人乳头瘤病毒16(HPV16)E7蛋白,试图解决新疆维吾尔妇女高发宫颈癌的诊断、疫苗的研究中抗原蛋白需要的问题.依据新疆维吾尔妇女宫颈癌组织克隆获得的HPV16-E7基因序列设计引物,并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点,经PCR扩增后连接到pMD18-T载体上,再将HPV16-E7克隆至穿梭质粒pGAPZαA上,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA-E7经线性化后.采用LiCl法将重组穿梭质粒转入酵母细胞内,Zeocin+筛选阳性克隆,经小瓶发酵后,取上清作SDS-PAGE,并做Western印迹检测表达的蛋白质,结果表明HPV16-E7成功地在酵母真核表达系统获得表达,表达产物的分子量分别是22KDa和88KDa,为深入开展HPV16-E7蛋白功能和应用的研究奠定了理论基础.

HPV16-E7蛋白和Survivin在宫颈鳞癌及其癌前病变组织中的表达及意义

目的探讨HPV16-E7蛋白和Survivin在宫颈鳞癌和宫颈上皮内瘤变(CIN)组织中的表达以及其在宫颈癌发生、发展中的作用。方法取宫颈鳞癌组织30例、CIN组织90例(其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各30例),采用免疫组化EnVision二步法检测标本中HPV16-E7蛋白和Survivin的表达,另取正常宫颈组织10例为对照组。结果 HPV16-E7蛋白和Survivin在宫颈鳞癌及CIN组织中的表达随宫颈病变进展而呈递增趋势,且二者呈正相关(r=0.340,P=0.000);HPV16-E7蛋白和Survivin在宫颈鳞癌组织中的表达与患者年龄、临床分期、病理分级、淋巴结转移均无明显关系。结论 HPV16-E7蛋白和Survivin与宫颈癌的发生、发展密切相关。

全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性研究

目的构建人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应。方法将HPV16 E7 cDNA亚克隆入酵母表达载体pYES2/NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL/6小鼠。ELISA、MTT、LDH法分别检测疫苗诱导的细胞因子、脾淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答水平。结果全酵母疫苗能够有效表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够刺激脾淋巴细胞增殖,并诱导出Th1型细胞因子和特异性CTL杀伤效应;免疫效果优于单纯HPV16-E7蛋白免疫(P<0.01)。结论全酵母疫苗既能表达HPV16-E7蛋白,又能有效诱导特异性CTL免疫应答。研究结果为进一步进行疫苗抗肿瘤疗效研究,提供了实验基础。

宫颈癌组织中CIP2A和HPV16-E7的表达及其临床意义分析

目的 探讨宫颈癌（Cervical cancer）、宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial,CIN）及正常宫颈组织中CIP2A、HPV16-E7的表达及其之间的相互关系。方法 应用免疫组化S-P法检测50例宫颈鳞状细胞癌、34例CINⅠ、40例CINⅡ、45例CINⅢ和12例正常宫颈组织中CIP2A、HPV16-E7蛋白的表达。结果 CIP2A在宫颈癌、CINⅢ阳性表达率分别为68%（34/50）、13.3%（6/45）;而在CINⅡ、CINⅠ及正常宫颈组织中阳性表达率均为0%。CIP2A蛋白在宫颈癌中的表达明显高于宫颈上皮内瘤变及正常宫颈组织,且与组织学分级、临床分期及淋巴结转移有关,差异均有统计学意义（P＜0.05）。HPV16-E7蛋白在宫颈癌、CINⅢ、CINⅡ及CINⅠ组织中的阳性表达率分别为72%（36/50）、68.89%（31/45）、67.50%（27/40）及64.71%（22/34）;而在正常宫颈组织中阳性表达率为16.67%（2/12）。HPV16-E7蛋白在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达明显高于正常宫颈组织,差异均有统计学意义（P＜0.05）,且与年龄有关,而与组织学分级、临床分期及淋巴结转移无关。CIP2A 与HPV16-E7蛋白的表达呈正相关（r=0.514,P＜0.05）。结论 CIP2A、HPV16-E7在宫颈鳞状细胞癌中的过表达,提示宫颈癌中CIP2A与HPV16可能相互协调,共同促进宫颈癌的发生发展。

Survivin、HPV 16-E7蛋白、VEGF在宫颈鳞癌及癌前病变中的表达及临床意义

目的探讨Survivin、HPV16-E7蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)在宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤样病变组织中的表达及在宫颈癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组化SP法检测50例宫颈鳞癌、90例宫颈上皮内瘤变(其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ各为30例)中Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF的表达,另取正常宫颈者20例为对照组。结果 Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF在宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤变(CINⅡ、CINⅢ)中的表达均随宫颈病变而呈递增趋势(P<0.05);Survivin的高表达与分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05);VEGF的高表达与分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05);HPV16-E7蛋白的高表达与分化程度、临床分期及淋巴结转移无关(P>0.05)。Survivin与HPV16-E7蛋白和VEGF的表达间存在正相关(r=0.417,P<0.01;r=0.378,P<0.01)。结论 Survivin、HPV16-E7蛋白及VEGF与宫颈癌的发生、发展密切相关。

早期宫颈癌组织中ATG-12表达与HPV16-E6/E7-DNA病毒载量及预后的关系

目的探讨早期宫颈癌组织中自噬相关蛋白-12(ATG-12)与人乳头瘤病毒(HPV)16-E6/E7-DNA病毒载量及预后的关系。方法选取2015年1月至2017年12月期间在安徽皖北煤电集团总医院保存的宫颈活检或手术切除宫颈组织203例,包括30例慢性宫颈炎、18例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ、23例CINⅡ、26例CINⅢ和106例早期(ⅠA2~ⅡB期)宫颈鳞状上皮癌(CSCC)。采用巢式多重聚合酶链式反应(NM-PCR)和免疫组化染色SP法检测组织中HPV 16-E6/E7-DNA病毒载量和ATG-12蛋白表达。分析ATG-12蛋白表达与早期CSCC临床病理特征的关系。随访CSCC患者无瘤生存时间(DFS)。采用Cox风险比例回归模型分析影响CSCC预后的因素。结果CSCC组织ATG-12蛋白阳性表达率为26.42%(28/106),低于慢性宫颈炎和CIN组织(P<0.05)。ATG-12蛋白表达与HPV16-E6/E7-DNA病毒载量呈负相关(r=-0.306,P=0.001;r=-0.436,P=0.001)。ATG-12蛋白表达与FIGO分期、间质浸润、淋巴脉管间隙浸润、淋巴结转移有关(P<0.05)。随访11~64个月,ATG-12蛋白阳性表达患者5年无瘤生存率为78.57%(22/28),ATG-12蛋白表达阴性患者5年无瘤生存率为60.26%(47/78)。多因素Cox风险回归模型结果显示,HPV16-E6/E7-DNA病毒载量和ATG-12蛋白表达是影响患者DFS的独立预后因素(P<0.05)。结论早期宫颈鳞状上皮癌组织中ATG-12阳性表达率低,与HPV16-E6/E7-DNA病毒载量呈负相关,有望成为评估HPV阳性早期宫颈癌患者预后的重要指标。

人乳头瘤病毒16型E7基因靶向调控cGAS-STING信号通路抑制宫颈癌细胞免疫功能的研究

目的:探讨HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路对宫颈癌细胞免疫功能的影响。方法:体外构建HPV16 E7过表达和干扰质粒,转染至SiHa细胞,qPCR检测HPV16 E7 mRNA表达水平,流式细胞术检测CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。在此基础上分别转染cGAS-siRNA和STING-siRNA至SiHa细胞,CCK8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。qPCR和Western blot分别检测cGAS、STING、IFN-Ⅰ、HPV16 E7的mRNA及蛋白表达。流式细胞术检测细胞CD95、MICA/B、CD73、CD39、CTLA-4和CD25表达。结果:STING-siRNA+HPV16 E7过表达组CD95和MICA/B水平降低(P<0.05),CD73、CD39、CTLA-4和CD25水平升高(P<0.05)。cGAS、STING和IFN-Ⅰ蛋白表达水平降低(P<0.05)。STINGsiRNA+HPV16 E7干扰组结果与之相反。结论:HPV16 E7靶向调控cGAS-STING信号通路进而抑制宫颈癌细胞免疫功能。

表达HPV16-E6/E7基因的人喉鳞癌细胞系的建立

目的建立表达HPV16-E6/E7基因的人喉鳞癌细胞系。方法用阳离子脂质体基因转染技术将携带有HPV16-E6/E7DNA的真核表达质粒导入体外连续传20代的HPV阴性的Lscc-02喉鳞癌细胞系,采用PCR和Western blot检测HPV16-E6/E7基因在Lscc-02细胞系中的整合和表达。结果第22代和第35代细胞中,PCR和Western blot均分别检测出E6/E7基因和蛋白的存在,显示HPV16-E6/E7基因整合于Lscc-02细胞系中并能稳定表达。结论成功建立了表达HPV16-E6/E7基因的人喉鳞癌细胞系,为进一步研究HPV16-E6/E7基因在喉癌细胞中的作用机制以及喉癌的基因治疗奠定了基础。

重组人干扰素α_2β治疗后HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和VEGF＿C表达水平对宫颈鳞癌的预测价值研究

目的研究重组人干扰素α_2β治疗后高危(high risk,HR)HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和VEGF_C表达水平变化及其对宫颈鳞癌的预测价值。方法选取35例慢性宫颈炎、25例宫颈鳞癌前病变以及30例宫颈鳞癌患者作为研究对象,患者均接受重组人干扰素α_2β治疗。分别于治疗前后,应用第2代杂交捕获法测定HR HPV DNA负荷量,应用SP免疫组化法测定HPV16-E7蛋白和VEGF_C表达水平。应用SPSS软件分析HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和VEGF_C对于宫颈鳞癌的预测价值。结果治疗后,宫颈鳞癌组HR HPV DNA负荷量显著高于癌前病变组(P<0.05),癌前病变组显著高于慢性宫颈炎组(P<0.05)。与治疗前比较,各组的HPV16-E7蛋白和VEGF_C表达水平未显著降低,宫颈鳞癌前病变组显著高于慢性宫颈炎组(P<0.05),宫颈鳞癌组显著高于宫颈鳞癌前病变组(P<0.05)。多元逐步Logistic回归分析显示:宫颈鳞癌=-2.763+0.275 HR HPV DNA负荷量+1.581 HPV16-E7蛋白+1.216 VEGF_C(c2=36.781,P<0.001),经Hosmer-leme-show检验显示,观测数据与预测数据无显著性差异。ROC曲线显示,HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和VEGF_C联合用于宫颈鳞癌的预测的AUC最大(0.91)。结论重组人干扰素α_2β治疗后,HR HPV DNA负荷量联合HPV16-E7蛋白和VEGF_C对宫颈鳞癌的预测效果较好。

HPV_(16)L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640+10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。

宫颈癌中CALCA基因甲基化与HPV16-E7致癌蛋白表达的依存关系

选择HPV16阳性宫颈癌细胞和RNAi技术,研究CALCA基因甲基化与HPV16-E7致癌蛋白表达的依存关系。构建慢病毒siRNA重组表达载体,建立稳定表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型。以SiHa细胞和RNAi细胞模型的基因组DNA为对象,选择CALCA基因启动子区富含CpG岛屿的目标片段,使用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)筛查分析,研究RNAi抑制HPV16-E7表达后,CALCA基因甲基化状态的可逆性程度。选出CALCA基因启动子区富含CpG位点的目标片段,其大小为365 bp,含有19个CpG岛屿,发现其中13个CpG位点的胞嘧啶在SiHa细胞基因组DNA中发生了甲基化(13/19),而在表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型中,所有CpG位点的甲基化已发生逆转(0/19位点)。本研究从细胞水平证明了宫颈癌细胞内的CALCA基因启动子高甲基化对HPV16-E7致癌蛋白表达有依赖性,为进一步研究E7蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。

子宫颈鳞癌中MTA1、CDK8、HPV 16-E7的表达及其意义

目的探讨MTA1、CDK8和HPV 16-E7在子宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组化SP两步法对10例慢性子宫颈炎、20例子宫颈上皮内病变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和70例子宫颈鳞癌进行MTA1、CDK8及HPV 16-E7蛋白检测,分析其临床病理特征。结果在慢性子宫颈炎、CIN及子宫颈鳞癌中,MTA1的阳性率分别为10.0%、35.0%、64.3%;CDK8的阳性率分别为0、10.0%、74.3%,HPV 16-E7的阳性率分别为20.0%、45.0%、70.0%(P均<0.05)。MTA1和CDK8的表达与子宫颈鳞癌临床分期、组织分化、淋巴结转移及浸润深度密切相关(P<0.05)。HPV 16-E7表达与患者年龄、肿瘤直径、分化程度、临床分期及有无淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。子宫颈鳞癌组织中,MTA1与CDK8及HPV 16-E7蛋白表达呈正相关(r=0.463、r=0.628,P均<0.05)。结论MTA1和CDK8的过表达促进子宫颈鳞癌的浸润转移,联合检测MTA1、CDK8蛋白表达可作为预测子宫颈鳞癌的浸润转移及评价患者预后的生物学指标。MTA1可能是HPV16-E7作用的潜在靶基因,在子宫颈鳞癌的发生、发展中起重要作用。

HPV16-E7肽段鼻腔免疫联合淋巴毒素清除小鼠生殖道HPV16-E7慢病毒感染的作用

目的研究HPV16-E7肽段鼻腔免疫联合淋巴毒素(LT)清除小鼠生殖道HPV16-E7慢病毒感染的作用。方法建立HPV16-E7慢病毒感染模型。建模成功的小鼠24只随机均分为四组:A组实施HPV16-E7肽段鼻腔免疫,B组静脉注射LT,C组采用HPV16-E7鼻腔免疫+LT静脉注射,D组应用PBS作为对照。鼻腔免疫分别于建模后0、14和28d各进行1次。其后收集小鼠阴道黏膜组织及生殖道淋巴结,检测小鼠阴道组织中HPV16-E7蛋白的表达及淋巴结中淋巴归巢相关因子的表达情况。结果与B组和D组比较,C组及A组淋巴归巢因子在淋巴结中表达分别呈(■)及(+),HPV16-E7蛋白表达量下降(P<0.05)。结论 HPV16-E7肽段鼻腔免疫后,HPV16-E7慢病毒感染小鼠清除HPV16-E7的能力增加。LT能有效提高经鼻腔诱导的免疫效应,可能通过促进淋巴细胞的活化和调节淋巴归巢相关因子表达而增强免疫应答效应。

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法，从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段，采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法，将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体，构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ，Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１，回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段，利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点，产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段，将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ，构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒，ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ，释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段，定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体，成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ。

慢病毒介导的HPV16-E7基因RNAi细胞模型的建立

建立HPV16-E7基因的RNAi细胞模型,可为进一步研究HPV16-E7蛋白作用及致癌机制提供物质前提。选择HPV16-E7基因特异的siRNA片段,构建慢病毒siRNA重组表达载体,经293FT病毒包装细胞转染产生重组病毒,并以此感染HPV16阳性SiHa宫颈癌细胞、抗菌素筛选和分子生物学鉴定,建立了稳定表达HPV16-E7-siRNA的RNAi细胞模型。该细胞模型,对目标基因(E7)表达的抑制效率,也以蛋白免疫印迹和RT-PCR确证。由此得出,利用慢病毒载体和HPV16-E7基因特异的siRNA片段,可以建立一种稳定、有效和可行的RNAi细胞模型,为进一步研究E7蛋白的作用及致癌机制奠定了重要的物质基础。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合HPV16E7-DNA疫苗治疗宫颈癌的效果及机制研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)伏立诺他(SAHA)联合人乳头瘤病毒16 E7-DNA(HPV16E7-DNA)疫苗治疗宫颈癌的效果及免疫机制。方法建立TC-1宫颈癌小鼠模型,负瘤第5天,采用随机数字表法将小鼠分为HPV16E7-DNA组、SAHA组、SAHA联合HPV16E7-DNA组、对照组,用药方案:HPV16E7-DNA组给予疫苗5μg/kg,SAHA组给予SAHA 20 mg/kg,SAHA联合HPV16E7-DNA组给予疫苗5μg/kg+SAHA 20 mg/kg,对照组给予100μL磷酸盐溶液(PBS)。每3天1次,共4次。绘制肿瘤生长曲线;流式细胞仪检测各组小鼠外周血CD8^+T细胞的数量;体外实验检测不同剂量SAHA(25.0、12.5 nmol/L)对TC-1细胞MHCⅠ类分子H-2K^b表达的影响。结果与其他三组比较,SAHA联合HPV16E7-DNA组的肿瘤生长速度明显减慢,小鼠外周血HPV16E7特异性CD8^+T细胞的数量增高(P<0.05)。体外实验结果提示,与对照组比较,SAHA组细胞MHCⅠ类分子H-2K^b的表达明显增高(P<0.05),低剂量与高剂量SAHA组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HDACI联合HPV16E7-DNA疫苗可能通过上调肿瘤细胞MHCⅠ类分子的表达,激活机体CD8^+T细胞免疫反应,从而产生明显的抗肿瘤效应,有望用于宫颈癌的免疫治疗。

rBCG-HPV16L1-E7疫苗的构建和免疫原性研究

[目的]构建以BCG为载体的rBCG-HPV16L1-E7疫苗,研究rBCG-HPV16L1-E7重组表达体嵌合乳头状瘤病毒样颗粒(VLPs)对小鼠免疫功能的影响,初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤(宫颈癌)的预防作用。[方法]电穿孔法将pIJ702-HPV16L1-E7分泌型穿梭表达质粒导入BCG中表达,构成rBCG-HPV16L1-E7疫苗。Western blot检测E7蛋白的表达。采用rBCG-HPV16L1-E7疫苗皮下注射于C57BL/6小鼠,51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性(cytotoxic T lymphocyte,CTL),ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体和细胞因子的表达水平。[结果]Western blot法分析证实,该重组疫苗能特异地表达HPV16 E7蛋白。以rBCG-HPV16L1-E7免疫小鼠后,检测到的细胞因子IL-2、IFNγ及E7抗体的含量明显升高,诱导机体产生特异的抗体反应以及CTL反应。[结论]rBCG-HPV16L1-E7能增强小鼠的细胞和体液免疫反应,可作为HPV16预防性疫苗。

人乳头瘤病毒HPV16 E7蛋白基因在沙门氏菌疫苗菌株X4072中的表达

采用ＰＣＲ方法，从ＨＰＶ１６型质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｅ７基因片段，用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶解后，定向插入到表达质粒ｐＹＡ３３３２（ａｓｄ＋）的Ｐｔｒｃ启动子下游，构建成ｐＹＡ３３３２－ＨＰＶ１６－Ｅ７重组表达质粒。在大肠杆菌Ｘ６２１２上筛选出重组质粒后，通过中间菌株Ｘ３７３０的转化过渡，将重组质粒导入鼠伤寒沙门氏减毒疫苗菌株Ｘ４０７２（ａｓｄ－），构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的ＨＰＶ１６型重组疫苗。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ染色和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法分析证实。