利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP两种抗原在检测宫颈癌抗 16L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别 ,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长15 35bp的HPV16L1基因片段 ,克隆至 pUC18 T载体中 ,进行DNA测序鉴定。然后 ,将HPV16L1基因克隆至pGEX 2T表达载体中 ,并诱导表达HPV16L1融合蛋白 ,分子量为 83kD ,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经GST柱层析法纯化后 ,与重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP分别经酶联免疫吸附 (ELISA)法检测 12份宫颈癌患者和 35份献血员血清。 12例宫颈癌血清标本中 ,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为 7例 (占 5 8.3% ) ;抗HPV16L1 VLP的抗体阳性率为 8例 (占 6 6 .7% )。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG(+)的 7份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测均阳性 ;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG( )的 5份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测有 1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异 (P >0 .0 5 )。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关 ,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1 VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16L1对宫颈癌的抗体进行定性。

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 HPV16L1重组蛋白的表达为研制HPV16L1预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 pPIC3 5 HPV16L1 GS115阳性菌株 ,经 0 5 %甲醇诱导 ,运用SDS PAGE电泳检测L1蛋白 ;用鼠抗HPV16L1单克隆抗体 ,经WesternBlotting检测蛋白的特异性 ;在透射电镜下观察类病毒颗粒 (VLPs)。结果 SDS PAGE检测结果表明 ,在5 5KD处有诱导蛋白带的出现 ;经WesternBlotting验证 ,该蛋白能与HPV16L1单克隆抗体特异结合 ,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白 ;电镜下见到了直径约为 5 0nm、形态结构与天然病毒颗粒极其相似的VLPs。结论 pAIC3 5 HPV16L1重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HPV16L1晚期蛋白 ,该蛋白在酵母菌中可自我组装成VLPs。

宫颈癌组织中HPV16L1蛋白质的表达及意义

为探讨人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白表达与宫颈癌发生与发展的关系,为防治宫颈癌奠定基础。采用收集宫颈癌患者48例、宫颈上皮内瘤样病变(cervcal intraepithelial neoplasia,CIN)患者41例和慢性宫颈炎患者30例石蜡组织标本用于免疫组织化学实验的方法。检测HPV16 L1蛋白在宫颈癌组织、CIN组织和慢性宫颈炎组织中的蛋白质表达状况。HPV16 L1蛋白质免疫组织化学实验的结果显示,慢性宫颈炎组织中阳性率为100%,而在宫颈癌组织中阳性率仅为27.1%,差异有统计学意义(P<0.01)。慢性宫颈炎组织的阳性率明显高于宫颈癌组织。由此可知,HPV16 L1蛋白质在宫颈原位癌开始表达减少,宫颈浸润癌表达减少更明显,可能可以用于诊断CINⅡ和CINⅢ或CINⅡ和宫颈癌。

HPV16L1VLP纯化、鉴定及血凝抑制实验方法的建立

摘要通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达HPV16L1 VLP,纯化鉴定后利用其建立血凝抑制实验,检测HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。利用重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞表达HPV16L1蛋白,大量获得VLP;优化扩增蛋白的条件并用SDS-PAGE分析鉴定;经氯化铯密度梯度离心法纯化VLP;利用所得VLP建立血凝抑制试验,鉴定制备的HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。优化蛋白表达条件结果显示,当重组杆状病毒感染细胞的MOI=10时目的蛋白表达量最大;按此滴度感染悬浮培养的昆虫细胞,收获、纯化VLP并鉴定其特异性;利用所得VLP建立了血凝抑制实验,鉴定HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制效价为1∶16。建立的血凝实验,可用于鉴定和检测HPV16L1相关抗体,为HPV诊断试剂的开发提供实验基础。

LDH法检测pcDNA-HPV16L1免疫小鼠CTL活性的研究

目的观察pcDNA-HPV16L1免疫BALB/c小鼠细胞毒性T细胞(CTL)活性变化,建立简便易行的CTL检测体系,为人乳头瘤病毒(HPV)疫苗免疫中CTL作用的研究奠定基础。方法用pcDNA-HPV16L1转染的小鼠黑色素瘤B16细胞作为靶细胞,用pcDNA-HPV16L1免疫BALB/c小鼠(观察组)并以乳酸脱氢酶(LDH)法检测其CTL活性,设空质粒组与空白组作为对照(分别肌注空质粒和葡萄糖)。结果与空质粒组和空白组比较,观察组CTL活性显著增强。结论pcDNA-HPV16L1免疫小鼠的CTL活性增强,LDH法可稳定检测。

人乳头状瘤病毒(HPV)16L1病毒样颗粒蛋白与HPV16L1基因联合免疫的体液免疫反应及其抗体的体外中和实验

目的用含有编码人乳头状瘤病毒(HPV)16L1和HPV16L1病毒样颗粒(VLP)蛋白联合免疫小鼠,与用HPV16L1重组表达质粒比较,观察VLP蛋白免疫对免疫小鼠产生抗体的增强作用,以及抗体的体外中和作用,寻找研制HPV16感染的预防性疫苗的有效途径。方法将C57BL/6小鼠,随机分为4组:Ⅰ组:pcDNA-L1(100μl/鼠),Ⅱ组:pcDNA-L1(70μl/鼠)+HPV16L1VLP,Ⅲ组:pcDNA3.1(100μl/鼠)空质粒,Ⅳ组:PBS缓冲液。质粒免疫3次,间隔3周。ELISA法检测其血清抗体,红细胞凝集实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验体外检测抗体的中和活性。结果pcDNA-L1+HPV16L1VLP较pcDNA-L1免疫组,3次免疫后的抗体水平均增高,尤其以第2次和第3次免疫后的抗体水平增加更显著。pcDNA-L1+HPV16L1VLP联合免疫组血清的抑制活性高于pcDNA-L1免疫组,且HeLa细胞结合抑制实验染色呈阴性。结论HPV16L1VLP联合免疫可以增加目的抗原的中和抗体产生,可能是HPV16有效预防性疫苗研制的更有希望的策略。

共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组非复制型痘苗病毒构建及鉴定

目的构建共表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1、L2、E6、E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1、L2、E6、E7基因插入;经WesternBlot检测,重组病毒能稳定表达HPV16L1、L2、E6、E7蛋白。结论非复制型重组痘苗病毒NTVJE6E7CKL1L2可作为预防和治疗HPV16相关肿瘤及其癌前病变候选疫苗。

HPV16L1-E7重组腺病毒在SCID-Hu IC小鼠和HPV16阳性肿瘤联合嵌合小鼠中防治作用的研究

目的 建立SCID HuIC小鼠动物模型和HPV16阳性肿瘤联合嵌合模型 ,研究HPV16L1 E7重组腺病毒在SCID HuIC小鼠和肿瘤联合嵌合模型中的防治作用。方法 ①实验组SCID小鼠移植人胎儿多组织 ,对照组注射RPMI 16 4 0培养液 ,8周末检测人IgG抗体 ,人CD4 5、CD3、CD19;②T1和C1组先注射HPV16L1 E7重组腺病毒 ,2周末强化 ,4周末接种CaSki细胞 ;T2和C2组先接种CaSki细胞 ,4周末注射HPV16L1 E7重组腺病毒 ,6周末强化。 8周末检测病毒特异性IgG抗体、人IFN γ及T淋巴细胞增殖 ,测定肿瘤的物理指标以及免疫组化实验。结果 ①实验组人IgG抗体阳性率 90 .0 % (18/ 2 0 ) ,CD4 5为 (49.79± 39.18) % ;CD3为 (42 .2 7± 36 .37) % ;CD19为 (9.2 8±7.4 6 ) % ,对照组人IgG抗体、人CD4 5、CD3及CD19均为阴性 ;②T1和T2组病毒特异性IgG抗体均为阳性、人IFN γ的含量和T淋巴细胞增殖实验 ,病毒特异性蛋白刺激组均高于非刺激组 (P <0 .0 5 ) ,C1和C2组病毒特异性IgG抗体为阴性、人IFN γ的含量及T淋巴细胞增殖均为阴性 ;肿瘤形成率 :T1和T2组分别为 0和 70 .0 % (7/ 10 ) ,而C1和C2组均为 10 0 % ;肿瘤大小 :T2组在 4周末时为 (4.35 5±0 .387)mm3 ,8周末为 (10 2 8± 90 .96 )mm3 ,C2组在 4周末时为 (32 .75± 6 .717)

HPV16L1基因甲基化在不同民族宫颈癌中的相关性分析

目的：探讨HPV16L1基因甲基化水平在维吾尔族和汉族女性宫颈癌之间的差异性;并探讨HPV16L1基因13个位点（5927、5963、6367、6389、6457、6581、6650、6731、6797、7034、7091、7136、7145）的甲基化率在同民族中的差异和在维吾尔族、汉族中的关联性,及其与病毒载量之间的相关性。方法：选取2012年9月-2014年10月在新疆维吾尔自治区人民医院妇科门诊及病房收集的宫颈标本108份,其中维吾尔族64份,汉族44份。采用焦磷酸测序的方法分别检测宫颈癌的HPV16L1 13个甲基化位点的基因甲基化率。结果：两民族宫颈癌标本13个甲基化位点甲基化率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。维吾尔族宫颈癌患者13个甲基化位点的甲基化之间的相关性：以位点5927为例,位点5927与剩余所有位点甲基化率之间的相关系数比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。汉族宫颈癌患者13个甲基化位点的甲基化之间的相关性：以位点5927为例,位点5927与位点5963、6367、6389、6457、6650、6731甲基化率之间的相关系数比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。HPV16L1基因13个位点的甲基化率在维吾尔族和汉族中,在6367、6389两个基因位点关联性密切。维吾尔族宫颈癌标本位点6797、7145的甲基化率与病毒载量之间的相关系数比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：HPV16L1基因甲基化在维吾尔族和汉族间无差异,但在单一民族内有差异,甲基化率与病毒载量有关。

密码子优化型HPV16L1基因在两种昆虫细胞中的表达

目的:提高16型人乳头瘤病毒(HPV16)L1基因在杆状病毒昆虫细胞中的表达水平,为研制预防性HPV疫苗奠定基础。方法:根据昆虫细胞密码子偏性对野生型HPV16L1基因进行改造,利用Bac-to-Bac表达系统获得重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9和High Five。Western blot鉴定表达产物;电镜下观察病毒样颗粒形成。利用ELISA法评价HPV16L1基因的优化效果,探讨L1蛋白表达的最佳条件。结果:在相对分子质量56kDa处出现HPV16L1的特异性条带;电镜下可见病毒样颗粒在昆虫细胞的核内形成;优化型HPV16L1基因的表达水平显著高于野生型。High Five细胞表达的最佳条件为MOI=10,表达时相72h,其L1蛋白表达量至少比Sf9细胞高3倍。结论:密码子优化技术确实能够促进HPV16L1蛋白的高效表达,而High Five细胞表现出的显著优势尤其值得关注。

弓形虫优势表位融合于HPV16L1“N端”的融合体可显著提高表位免疫反应性

弓形虫和人乳头瘤病毒(HPV)具有共同的免疫保护人群,选择HPV16型晚期结构蛋白1(HPV16L1)为载体,携带弓形虫多表位(RSepitope)以期提高表位免疫原性同时可实现共免疫效应。文中分别以构建的融合体RSepitope-HPV16L1(RSepitope融合于HPV16L1"N"端)以及HPV16L1-RSepitope(RSepitope融合于HPV16L1"C"端),脂质体转染COS-7细胞后,RSepitope-HPV16L1融合体形式可以在转染细胞中得到有效转录和翻译,分别可检测到相应的RSepitope和HPV16L1的mRNA和蛋白,但HPV16L1-RSepitope融合体形式在转染细胞中检测不到目标抗原的mRNA和蛋白。融合体采用"DNA初免-蛋白质加强免疫"的方案免疫BALB/c小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)分别检测到RSepitope-HPV16L1免疫鼠血清中显著升高的体液和细胞免疫反应(即最高水平的RSepitope特异性抗体IgG和IFN-γ),且比较单独RSepitope免疫组(不与HPV16L1融合),产生的是显著升高的Th1和Th2免疫反应类型,提示HPV16L1作为表位载体的优势效应。而HPV16L1-RSepitope融合体形式体内也未能诱导有效的免疫反应。以上研究提示,HPV16L1"N"端可能是较为合适的表位融合位置,融合体表位特异性免疫学效应显著提高,研究结果为提高表位疫苗的免疫原性提供了一个合理的载体融合策略。

基于自转运蛋白Ag43的HPV16L1蛋白的细菌表面展示

目的:通过构建含有不同大小乘客结构域的Ag43表面展示载体,观察其将外源蛋白HPV16L1展示在细菌细胞表面的效率。方法:(1)利用基因工程手段将不同长度的Ag43基因序列连接到pET22b载体,获得4种Ag43表面展示载体:Ag43/138、Ag43/551、Ag43/552、Ag43/700;(2)克隆HPV16L1编码基因序列,利用基因工程手段将其分别连接到上述4种Ag43表面展示载体,获得4种重组蛋白表达载体;(3)HPV16L1-Ag43融合蛋白表达及SDS-PAGE分析;(4)利用胰蛋白酶消化验证HPV16L1蛋白在大肠埃希菌的表面展示。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增获得的Ag43和HPV16L1条带与预期大小一致,表面展示载体和重组蛋白表达载体的基因序列均通过基因测序验证无误。经IPTG诱导后,构建的4种Ag43表面展示载体均能表达HPV16L1蛋白。胰蛋白酶消化后,4种重组蛋白条带均减弱,且Ag43/700-HPV16L1条带减弱最明显。结论:成功构建了基于自转运蛋白Ag43的细菌表面展示载体,HPV16L1蛋白可通过构建的4种Ag43表面展示载体表达并展示在大肠埃希菌表面,且仅保留α-螺旋和β-桶状结构域部分的Ag43表达载体即Ag43/700的表面展示效果最优。

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

HPV_(16)L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640+10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。

ELISPOT检测特异性抗体形成细胞功能

目的:建立一种简便的ELISPOT方法,用于检测和评价特异性抗体形成细胞的功能,并观察HPV16L1蛋白疫苗接种小鼠诱发体液免疫的效应。方法:将HPV16L1抗原或抗鼠IgG的俘获抗体包被在预先贴有硝酸纤维素膜的培养板微孔内,取被HPV16L1蛋白疫苗免疫的鼠脾细胞,经HPV16L1抗原刺激后加到微孔内,已固定的抗原/抗体可与细胞分泌出的抗体结合。再加入RAM-HRP标记的羊抗鼠IgG和沉淀性废物溶液(DAB),可在有HPV16L1特异抗体产生细胞的位置产生棕褐色的斑点,每个斑点代表一个分泌细胞。同时ELISA法检测血清与脾细胞上清液中HPV16L1特异性IgG水平。结果:免疫组HPV16L1特异性抗体生成细胞的频数明显高于对照组。结论:ELISPOT法较ELISA法更灵敏,HPV16L1疫苗可有效刺激小鼠产生特异性抗体。

基于抗原表位分析的人乳头瘤病毒16L1壳蛋白基因克隆及表达纯化

目的：选择人乳头瘤病毒（HPV）16L1抗原性最强的一段抗原表位编码区,构建原核表达载体并利用大肠杆菌表达抗原蛋白,为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。方法：借助DNAstar软件分析HPV16L1的CDS区,选择抗原性最强的一段抗原表位编码区,提取HPV16L1编码区的DNA。目的 DNA和p ET32a质粒分别进行双酶切,连接并转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆后转化BL21大肠杆菌,诱导产生HPV16L1重组蛋白,通过市售抗体对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定。结果：利用DNAstar软件,选择了抗原表位较富集的碱基序列919~1314bp区段,按常规制备重组蛋白的方法成功制备HPV16L1重组蛋白。抗体鉴定表明,制备的重组蛋白抗原特异性良好。结论：有针对性地制备HPV16L1重组蛋白,可避免其他抗原表位的干扰。经鉴定,HPV16L1重组蛋白抗原特异性良好,将为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。

HPV16 L1蛋白在原核表达系统中的表达与纯化

目的 建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法 ,纯化目的蛋白。方法 构建pGEX4T HPV16L1表达质粒。在大肠杆菌BL2 1表达系统中表达 ,经过包涵体提取 ,8mol/L尿素溶解 ,分级透析除去尿素 ,亲和层析进行提纯。结果 HPV16L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在 ,通过本方法可以获得纯化的蛋白。结论 建立了一套纯化HPV16L1蛋白的方法。