HPV18晚期蛋白L1在毕赤酵母菌中的表达及鉴定

目的:用毕赤酵母胞内表达载体构建含人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1基因质粒,诱导表达并进行鉴定。方法:按照毕赤酵母密码子偏爱性原则,合成全长L1基因,然后克隆到pAO819表达载体上,在体外分别构建含一个拷贝和二个拷贝的L1基因载体。线形化后转化到GS115酵母细胞,经G418抗性筛选,获高拷贝重组子并经甲醇诱导表达,表达产物采用化学发光Western blot鉴定,一抗为抗HPV18L1蛋白鼠抗血清。结果:在55kDa处有诱导蛋白免疫印迹出现,并在电镜下观察到HPV18的病毒样颗粒(VLPs),证明该表达系统能表达出HPV18 L1蛋白。结论:本实验构建的毕赤酵母表达菌株,可经甲醇诱导表达HPV18L1晚期蛋白,为进一步研制人乳头瘤病毒18型基因工程疫苗打下基础。

高危型HPV阳性患者中HPVL1蛋白的表达及临床意义

探讨HPV-L1蛋白在宫颈细胞学高危型HPV阳性患者中的表达及临床意义。方法 选取187例高危型HPV阳性宫颈液基细胞学标本,其中未见上皮内瘤样病变及恶性细胞(NILM)40例,非典型鳞状上皮细胞(ASC-US)68例、低度鳞状上皮内瘤变(LSIL)39 例、非典型鳞状上皮细胞-不除外高度(ASC-H)13例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)24例、鳞状细胞癌(SCC)3例,用赛泰(CytoReact?)免疫组织化学染色检测 HPV L1 蛋白的表达,187例样本中同时具有宫颈细胞学和病理学诊断结果的111例。同时将细胞学诊断与病理诊断相对照。 结果 不同细胞学诊断患者HPV L1蛋白阳性表达率分别为NILM 5%、ASC-US 48.5%、LSIL 61.5%、ASC-H 8%、HSIL 0%、SCC 0%,比较差异显著,有统计学意义(χ2=36.100,P<0.01);不同病理学诊断患者HPV L1蛋白阳性率分别为:炎症66.6%、CIN 1 50%、CIN 2 10%、CIN 3 9%、SCC 0%,比较差异显著,有统计学意义(χ2=22.285,P<0.01)。随着病变级别的增加,HPV L1的表达逐渐下降。结论 HPV L1蛋白表达缺失和高危型人乳头瘤病毒感染的持续存在是ASC-US和LSIL患者进展为CIN2及以上病变的可靠预测因子。

表达HPV18晚期蛋白L1重组毕赤酵母在30L Sartorious生物反应器(C_(30)-3)中的培养与诱导工艺摸索及优化

采用改良后的低盐培养基在30 L Sartorious生物反应器(C30-3)对表达18型人乳头瘤病毒(Human papillom avirus,HPV)晚期蛋白L1重组毕赤酵母进行培养,探讨了在重组毕赤酵母细胞积累阶段和HPV18晚期蛋白L1诱导表达阶段不同的培养基配方、p H值、温度、搅拌转速、溶氧(DO)、重组毕赤酵母细胞积累阶段甘油的补加方式、去除阻碍物甘油的去阻碍时间、重组毕赤酵母表达HPV18晚期蛋白L1阶段诱导剂甲醇的补加方式等工艺参数对表达HPV18晚期蛋白L1重组毕赤酵母的影响。优化后的低盐培养基更适合重组毕赤酵母细胞的生长;重组毕赤酵母细胞积累阶段的培养过程中维持培养液p H值5.0,温度31℃,DO 20%~25%,搅拌转速500 r/min,培养到第20 h开始以恒速补加3 000 m L 40%甘油溶液,培养至重组毕赤酵母细胞湿重≥190 g/L,停止甘油补加,继续培养重组毕赤酵母4 h,消耗阻碍HPV18晚期蛋白L1表达的甘油;之后进入重组毕赤酵母表达HPV18晚期蛋白L1诱导阶段,维持培养液p H值5.2,温度29℃,DO含量45%,搅拌转速600 r/min,控制培养液中甲醇浓度为4%在线补加甲醇,诱导60 h,HPV18晚期蛋白L1的表达量达到了311.43 mg/L。利用30 L Sartorious生物反应器(C30-3)对表达HPV18L1重组毕赤酵母进行培养,经过多次试验建立起了稳定的重组毕赤酵母表达HPV18晚期蛋白L1工艺。

HPV L1壳蛋白、CDC7、Spindlin1在不同程度宫颈病变中的表达及意义

目的检测HPV L1壳蛋白、细胞周期蛋白7(CDC7)、Spindlin1在不同程度的宫颈病变中的阳性表达水平,探究其临床意义。方法回顾性收集2019年3月至2020年12月于本院就诊的符合入组条件的人员253例,按照病理学检测分为正常宫颈62例,CINⅠ54例,CINⅡ~Ⅲ50例,宫颈鳞状细胞癌48例,浸润腺癌39例。按照细胞学检测结果分为无宫颈上皮内瘤变(NILM)57例,不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)48例,低级别鳞状上皮细胞(LSIL)40例,高级别鳞状上皮细胞(HSIL)52例,宫颈癌(SCC)56例,采用免疫组化法检测HPV L1壳蛋白、CDC7、Spindlin1在不同程度的宫颈病变中的阳性表达水平。结果HPV L1壳蛋白的阳性表达随着宫颈组织病变的程度增加而减少,CDC7、Spindlin1阳性表达随着宫颈组织病变的程度增加而增加,差异均具有显著性(P<0.05)。结论HPV L1壳蛋白、CDC7、Spindlin1在不同程度的宫颈病变患者中具有一定的筛查、诊断作用,三者联合可以作为宫颈癌进程研究的重要临床参考指标。

HPV-18型晚期基因L1在宫颈脱落细胞中的表达与突变研究

目的:研究人乳头瘤病毒HPV-18型晚期基因L1在不同宫颈上皮病变患者脱落细胞中表达分布与基因突变特征。方法:收集单纯感染人乳头瘤病毒HPV-18型宫颈上皮病变组织脱落细胞,免疫细胞化学分析其中L1基因的蛋白表达情况。提取总DNA,特异性引物针对HPV-18 L1基因进行PCR扩增检测,所得产物进行Sanger基因测序分析。结果:HPV-18 L1基因在宫颈炎、CINⅠ+Ⅱ级、CINⅢ级和宫颈癌组织中蛋白表达阳性率分别为100%、81.8%、34.6%和12.2%。在不同病理分级宫颈上皮病变患者脱落细胞标本中,HPV-18 L1蛋白表达阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。Sanger法基因测序显示L1基因序列存在突变,突变率9.2%,共发现11类核苷酸变异,其中4类属错义突变。结论:HPV-18型晚期基因L1蛋白表达量与宫颈组织病理病变严重程度呈负相关趋势。HPV-18 L1基因突变较为突出,存在地区流行型突变株。L1基因突变与宫颈恶性病变程度可能存在一定关系。

子宫颈病变中HPV L1蛋白和p16的表达

目的研究HPV L1蛋白和p16在子宫颈各种病变中的表达情况,探讨它们在子宫颈病变进展中的预测价值。方法应用免疫组化方法检测41例各种子宫颈病变(CIN1级18例、CIN2级9例、CIN3级8例和浸润性鳞状细胞癌6例)中HPV L1蛋白和p16的表达。结果HPV L1蛋白在各种子宫颈病变中的阳性率为26.8%。其中HPV L1在CIN1中的阳性表达率为38.9%,CIN2为44.4%,CIN3和浸润性鳞状细胞癌均无表达。p16在各种子宫颈病变中的阳性率为68.3%,其在CIN1中的阳性表达率为38.9%,CIN2为77.8%,CIN3和浸润性鳞状细胞癌均表达阳性。100%CIN3和浸润性鳞状细胞癌为p16+/HPV L1-,而61.1%CIN1中为p16-/HPV L1+或p16-/HPV L1-。结论随着子宫颈病变的进展,HPV L1阳性表达率降低而p16阳性表达率增高。p16+/HPV L1-提示子宫颈鳞状上皮内瘤变有进展的可能,而p16-/HPV L1+和p16-/HPV L1-可能为无进展的或潜在消退的子宫颈病变。

植物偏爱密码子优化HPV18L1全长基因的重叠PCR合成

目的以重叠PCR方法合成植物偏爱密码子优化后的人乳头瘤病毒18L1全长基因。方法自GenBank获取国内外所发布的HPV18L1全长基因序列,经生物信息学分析后选定目标序列,经Synthetic Gene Designer及JCat(JavaCodon Adaptation Tool)分析软件将此序列原始密码子改造为植物偏爱密码子,在C端加入蛋白纯化标签His-tag,获得改造后的HPV18L1全长序列(mHPV18L1)。结合酶切位点分析将mHPV18L1设计为204～477bp的五个大片段LS1-LS5,再将每个大片段分割成57～59bp的5～11个寡聚核苷酸短链,设计合成5对内引物和1对外引物,经重叠PCR扩增获得mHPV18L1全长基因,纯化后将其克隆入pMD18T载体,酶切、测序鉴定插入子。结果以重叠PCR成功扩增获得mHPV18L1全长,pMD18T-mHPV18L1重组质粒经酶切、PCR鉴定均得到预期1749bp大小的片段,并经测序验证。结论获得以植物偏爱密码子进行序列优化的mHPV18L1全长基因及其重组质粒pMD18T-mHPV18L1,为后续mHPV18L1的植物转化研究奠定了一定的工作基础。

GS环保试剂在HPV L1壳蛋白检测技术中的应用

原位杂交技术的广泛应用为各学科的研究带来突破性进展,其对组织标本的常规处理要求越来越高.在日常病理组织处理过程中,甲醛和二甲苯作为病理常规试剂被大量应用.但是传统试剂具有强烈的刺激性和一定的毒性,不利于环保和工作人员的健康.作者尝试应用环保型GS（green specimen）组织样本制备套液制作组织蜡块,并应用原位杂交技术检测HPV L1壳蛋白的表达,以探讨GS环保试剂对HPV L1壳蛋白检测的影响.

原核表达系统中HPV16L1蛋白的表达与纯化

为了建立 HPV16 L1蛋白原核表达系统的纯化方法 ,纯化目的蛋白 ,我们构建了 p GEX4 T- HPV16 L1表达质粒。在大肠杆菌 BL2 1表达系统中表达 ,经过包涵体提取 ,8M尿素溶解 ,分级透析除去尿素 ,亲和层析进行提纯。结果显示 ,HPV16 L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在 ,通过本方法可以获得纯化的 HPV16 L1蛋白 ,为 HPV16

HPVL1蛋白在宫颈鳞状上皮内病变中的表达及意义

目的:探讨HPV L1蛋白在宫颈鳞状上皮内病变(SIL)中的表达及意义。方法 :以免疫组织/细胞化学和非同位素标记核酸分子杂交技术为基础,在免疫水平和核酸水平上检测73例SIL患者中HPV L1蛋白的表达情况,取40例液基细胞学中宫颈无上皮内病变或恶性病变(NILM)作对照。结果:HPV L1蛋白在NILM中的阳性率是10.0%(4/40),在宫颈低度鳞状上皮内病变(LSIL)中的阳性率是54.2%(26/48),差异具有统计学意义(P<0.01)。HPV L1蛋白在宫颈高度鳞状上皮内病变(HSIL)中的阳性率是16.0%(4/25),与LSIL比较差异具有统计学意义(P<0.01)。HPV L1蛋白在不大于45岁SIL患者的阳性率是44.0%(22/50),在45岁以上SIL患者的阳性率是34.8%(8/23),差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)SIL的发生、发展可能和HPV L1蛋白的异常表达有关。(2)HPV L1蛋白可作为预测SIL发展的指标,协助临床处理。

人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。

P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白检测在宫颈鳞状上皮内病变诊断中的应用

目的初步探讨P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白检测在宫颈鳞状上皮内病变诊断中的应用价值。方法选择在温州市人民医院就诊患者,收集69例宫颈鳞状上皮内病变标本,行P16^(INK4A)、HPV L1壳蛋白检测,分析P16^(INK4A)、HPV L1壳蛋白及P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白在各级宫颈病变中的表达差异。结果 P16^(INK4A)在LSIL组、HSIL组、SCC组中的阳性率分别为45.5%、85.2%、100.0%。同LSIL组比较,P16INK4A在HSIL组及SCC组阳性率明显升高(P<0.01)。HPV L1壳蛋白在LSIL组、HSIL组、SCC组中的阳性率分别为63.6%、18.5%、0%,HPV L1壳蛋白在LSIL组中阳性率明显低于HSIL组及SCC组(P<0.01)。随着宫颈病变加重,P16+/L1-阳性率有升高趋势(P<0.01),P16-/L1+阳性率有下降趋势(P<0.01)。LSIL组中P16+/L1-阳性率明显低于HSIL组和SCC组(P<0.01),SCC组P16+/L1-阳性率较HSIL组有明显提高(P<0.05)。LSIL组中P16-/L1+阳性率明显低于HSIL组和SCC组(P<0.01)。P16+/L1-较P16^(INK4)、HPV L1壳蛋白单一检测筛查HSIL+特异性明显升高(P<0.01)。结论 P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白有望成为诊断宫颈鳞状上皮内病变的有效指标。

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。

免疫细胞化学法检测HPV L1壳蛋白在宫颈脱落细胞中的表达及临床价值探讨

目的:观察HPV L1壳蛋白在宫颈脱落细胞中的表达,探讨使用其临床应用价值。方法:选择2017年2月至2019年4月我院收治的高危型HPV阳性、阴道镜检查怀疑有宫颈病变的女性,从中选择210例患者的宫颈脱落细胞标本作为本次研究的对象。采用免疫细胞化学法检测HPV L1壳蛋白表达。观察其中160例高危型HPV阳性、阴道镜检查怀疑有宫颈病变女性的宫颈脱落细胞HPV L1壳蛋白表达检查结果。结果:本次检测中,HPV L1壳蛋白的总阳性率为40.00%。慢性宫颈炎、CINⅠ、Ⅱ、ⅢHPV L1壳蛋白阳性率存在明显的差异,具有统计学意义(P<0.05)。不同宫颈细胞学分组中HPV L1壳蛋白表达阳性率存在明显差异,HPV L1壳蛋白在NILM分组中阳性表达率最低。结论:HPV L1壳蛋白表达与宫颈脱落细胞病变类型存在明显的联系,HPV L1壳蛋白阳性表达与宫颈脱落细胞病变程度呈现负相关,采用免疫细胞化学法检测这一指标可作为临床预判宫颈病变进展风险的重要依据。

HPV16 L1蛋白在原核表达系统中的表达与纯化

目的 建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法 ,纯化目的蛋白。方法 构建pGEX4T HPV16L1表达质粒。在大肠杆菌BL2 1表达系统中表达 ,经过包涵体提取 ,8mol/L尿素溶解 ,分级透析除去尿素 ,亲和层析进行提纯。结果 HPV16L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在 ,通过本方法可以获得纯化的蛋白。结论 建立了一套纯化HPV16L1蛋白的方法。

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 HPV16L1重组蛋白的表达为研制HPV16L1预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 pPIC3 5 HPV16L1 GS115阳性菌株 ,经 0 5 %甲醇诱导 ,运用SDS PAGE电泳检测L1蛋白 ;用鼠抗HPV16L1单克隆抗体 ,经WesternBlotting检测蛋白的特异性 ;在透射电镜下观察类病毒颗粒 (VLPs)。结果 SDS PAGE检测结果表明 ,在5 5KD处有诱导蛋白带的出现 ;经WesternBlotting验证 ,该蛋白能与HPV16L1单克隆抗体特异结合 ,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白 ;电镜下见到了直径约为 5 0nm、形态结构与天然病毒颗粒极其相似的VLPs。结论 pAIC3 5 HPV16L1重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HPV16L1晚期蛋白 ,该蛋白在酵母菌中可自我组装成VLPs。

血清DKK1、sRAGE、hCAP-18对急性淋巴细胞白血病患儿的诊断和预后不良的预测价值

目的 探讨血清Dickkopf相关蛋白1(DKK1)、可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)、人类阳离子抗菌蛋白-18(hCAP-18)对急性淋巴细胞白血病患儿的诊断和预后不良的预测价值。方法 选取2020年4月至2022年4月南京鼓楼医院集团宿迁医院收治的84例急性淋巴细胞白血病患儿作为研究组,包括标危28例、中危36例、高危20例。另选取同期在南京鼓楼医院集团宿迁医院体检的84例健康儿童作为对照组。收集所有研究对象的临床资料。采用酶联免疫吸附试验检测所有研究对象血清DKK1、sRAGE、hCAP-18水平。对研究组患儿进行为期1年的随访,并按随访结果分为预后不良组和预后良好组。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清DKK1、sRAGE、hCAP-18在急性淋巴细胞白血病患儿诊断和预后不良的预测价值。采用多因素Logistic回归分析影响急性淋巴细胞白血病发生的因素。结果 与对照组相比,研究组患儿白细胞计数(WBC)、DKK1水平显著升高,sRAGE、hCAP-18水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与研究组标危患儿相比,中危和高危患儿血清DKK1水平显著升高,sRAGE、hCAP-18水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与中危患儿相比,高危患儿血清DKK1水平显著升高,sRAGE、hCAP-18水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。血清DKK1、sRAGE、hCAP-18联合诊断急性淋巴细胞白血病的曲线下面积(AUC)显著高于血清DKK1、sRAGE、hCAP-18单独诊断的AUC(Z=2.820,P=0.005;Z=5.170,P<0.001;Z=5.272,P<0.001)。多因素Logistic回归分析结果显示,血清WBC、DKK1、sRAGE、hCAP-18是急性淋巴细胞白血病发生的影响因素(P<0.05)。随访1年后,26例患儿纳入预后不良组,58例患儿纳入预后良好组。与预后良好组相比,预后不良组患儿血清DKK1水平显著升高,sRAGE、hCAP-18水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与预后不良组中危患儿相比,高危患儿DKK1水平显著升高,sRAGE、hCAP-18水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。血清DKK1、sRAGE、hCAP-18联合预测急性淋巴细胞白血病患儿预后不良的AUC明显高于血清DKK1、sRAGE、hCAP-18单独预测的AUC(Z=2.312,P=0.021;Z=3.160,P=0.002;Z=2.926,P=0.003)。结论 急性淋巴细胞白血病患儿血清DKK1高表达,sRAGE、hCAP-18低表达,且三者联合检测对急性淋巴细胞白血病具有一定的诊断和预后预测价值。

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达及病毒样颗粒的形成

目的利用大肠埃希菌系统可溶性表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,纯化和重组装获得HPV18病毒样颗粒(VLPs),为进一步研制HPV18基因工程疫苗奠定基础。方法首先按大肠埃希菌密码子偏好进行HPV18L1全基因合成,经PCR扩增出截短的HPV18L1基因,构建重组表达载体PET30a-L1,通过优化表达在大肠埃希菌BL21中可溶性表达L1蛋白,其次采用硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析后,获得高纯度的的L1蛋白,再通过解聚和重聚获得VLPs。结果全基因优化并截短的HPV18L1蛋白在大肠埃希菌系统中以可溶形式表达,纯化后的蛋白纯度达到90%以上,电镜下观察到直径为60 nm的VLPs颗粒。结论利用大肠埃希菌系统可溶性表达非融合HPV18L1蛋白,并获得均一的VLPs颗粒,为疫苗的开发奠定基础。

HPV6晚期表达基因L1的克隆并在杆状病毒表达系统的表达及其抗血清制备

目的 获得具有正确序列的人乳头瘤病毒 HPV6型晚期表达基因 L1 ,并获得其高活性表达 L1基因特异性抗血清 ,为进一步研究及临床检验应用奠定物质基础。方法 用 PCR法从感染人乳头瘤病毒患者尖锐湿疣组织中获得 HPV6晚期表达基因 L1 ,测序验证后 ,将正确的 HPV6晚期表达基因 L1序列 ,插入 Bac- to- Bac杆状病毒表达系统 ,转染昆虫细胞 Sf9,表达外壳蛋白 L 1 ,并以之作为抗原免疫兔 ,获得特异性抗血清。结果 获得了正确序列 HPV6晚期表达基因 L1 ,在 Bac- to- Bac杆状病毒系统活性表达并获得其特异性抗血清。结论 获得 HPV6晚期表达基因 L1 ,及有抗原活性的表达和相应抗血清。