HPV18-E6基因SiRNA对喉癌细胞的生长抑制作用

目的:探讨小分子干扰RNA(SiRNA)对喉癌细胞系Hep-2细胞中人乳头状瘤病毒HPV18型E6基因mRNA表达的干扰作用。方法:用Ambion公司pSilencer4.1CMV构建针对HPV18-E6基因的SiRNA真核表达载体,以携带HPV18-E6基因的人喉癌Hep-2细胞系为靶细胞,通过阳离子脂质体法转染SiRNA表达载体。RT-PCR分析转染后细胞HPV18-E6基因表达;Westernblot试验观察干涉后HPV18-E6蛋白的表达;流式细胞仪分析细胞增殖周期的改变。结果:成功构建了人HPV18-E6基因的RNA干涉真核表达载体psil-svvE6,并在Hep-2细胞中有效地发挥了对HPV18-E6基因表达的干涉作用。细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡。结论:HPV18-E6基因在喉癌细胞Hep-2生长中可能起到非常重要的作用,有望成为逆转喉癌细胞永生化的靶点。

siRNA抑制HPV18E6基因及其对HeLa细胞凋亡的影响

目的研究特异小干扰RNA(sm all interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap-illom avirus,HPV)18型E6基因的抑制及其对细胞凋亡的影响。方法针对HPV18E6基因设计siRNA序列,经PCR方法体外扩增,得到含有U6启动子以及siRNA序列的PCR产物,利用L ipofectam ineTM2000脂质体转染HeLa细胞,在U6启动子的作用下于细胞内转录siRNA。针对转染后不同时间点采用四唑盐(MTT)比色法测定细胞活力,流式细胞仪PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR测定HPV18E6 mRNA变化。结果转染siRNA后细胞活力受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,72 h的凋亡率达到55.8%。RT-PCR结果显示,细胞转染24、48和72 h后HPV18E6 mRNA分别减少了57%、78%和40%,而siRNA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论siRNA可特异有效的干扰宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,从而可诱导肿瘤细胞凋亡。

宫颈腺癌p53、HPV16/18-E6蛋白和ER的表达及其临床意义

目的 探讨宫颈腺癌组织中 p5 3蛋白、HPV16 / 18 E6蛋白及ER的表达及其临床意义。 方法 采用免疫组织化学S P法对 6 3例宫颈腺癌组织进行p5 3蛋白、HPV16 / 18 E6蛋白及ER检测。结果 6 3例宫颈腺癌中p5 3、HPV16 / 18 E6蛋白和ER阳性表达率分别为为 5 2 .3%、31.7%和 4 9.2 %。p5 3表达与肿瘤病理分级、临床分期 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期 )有关。HPV16 / 18 E6、ER的表达与宫颈腺癌的病理学分级、临床分期无关 ,但与 p5 3表达呈负相关 (P <0 .0 1) ,HPV16 / 18 E6、ER在宫颈腺癌中的表达呈正相关 (P <0 .0 1)。结论 随宫颈腺癌组织病理分级和临床分期增高p5 3阳性表达率逐渐增高 ,可能与 p5 3突变有关 ,部分宫颈腺癌的发病可能与HPV16 / 18 E6蛋白过度表达有关。部分宫颈腺癌可能属于激素依赖性 ,雌激素可能有协同HPV致癌的作用。

p53基因第72位密码子多态性与宫颈癌及HPV-16、18E6之间关系的研究

目的探讨宫颈癌及其癌前病变中p53基因第72位密码子多态性的表达及其与HPV16、18E6表达之间的关系，以了解p58基因第72位密码子多态性是否可以作为预测宫颈癌发生的一项高危因子。方法以PCR法检测81例宫颈鳞癌（高分化13例、中分化24例、低分化44例；Ⅰb期24例、Ⅱa期15例、Ⅱb期37例、Ⅲa期5例）、18例宫颈腺癌、88例宫颈上皮内瘤样病变（CINⅡ30例、CINⅢ58例）及60例正常宫颈组织中p53基因第72位密码子多态性及HPV16、18E6的表达。结果p53Arg纯合子、p53Arg／Pro杂合子及p53Pro纯合子在宫颈鳞癌、腺癌和CIN（Ⅱ～Ⅲ）中分别占58．02％、30．86％、11．12％；55．55％、27．78％、16．67％I59．09％、21．59％、19．32％。各组中p53Arg纯合子明显高于p53Arg／Pro杂合子及p53Pro纯合子，且差异有统计学意义（P〈0．05IP〈0．01）。正常宫颈组织中p53Arg纯合子、p53Arg／Pro杂合子及p53Pro纯合子分别为23．33％、40．OO％、36．67％，三者间无统计学意义（P〉0．05）。宫颈癌组（鳞癌及腺癌）、CIN（Ⅰ～Ⅱ）组中p53Arg纯合子均高于正常对照组中p53Arg纯合子，且差异有统计学意义（P〈0．05）；宫颈鳞癌中HPVl6、18E6（＋）亚组中p53Arg纯合子显著高于HPV16、18E6（-）亚组及HPVl6、18E6（＋）正常对照组亚组（P〈0．05，P〈0．01）。各组中p53Arg纯合子均高于p53Pro纯合子（P〈0．05）；p53Arg纯合子及等位基因均未随宫颈癌临床分期及分化程度而变化，与宫颈癌前病变程度亦无关系。结论p53Arg纯合子可作为预测宫颈癌及其癌前病变的一项高危因子，与高危型HPVE6同时检测可提示宫颈病变的发展趋势；p53Arg纯合子与宫颈癌临床分期及分化程度无明显相关性。

HPV16、18E6基因在喉癌组织中的表达

目的 检测HPV16、18E6基因在喉癌中的表达 ,探讨其在喉癌发病过程中的作用。方法 应用RT PCR、琼脂糖凝胶电泳方法检测 30例声带息肉组织及 48例喉癌组织。结果 30例声带息肉组织中 6 .6 7% (2 30 )有HPV16、18E6基因表达 ,48例喉癌组织中 87.5 % (4 2 48)扩增HPV16E6基因 ,79.17% (38 48)有HPV18E6基因表达。HPV16、18E6基因与喉癌的临床分型、病理分化程度、临床分期无明显关系 (P >0 .0 5 ) ,与淋巴结转移有关 (P <0 .0 5 )。结论 HPV16、18E6基因与喉癌的发生密切相关 ,是喉癌恶性转化的关键 。

表达HPV16-E6/E7基因的人喉鳞癌细胞系的建立

目的建立表达HPV16-E6/E7基因的人喉鳞癌细胞系。方法用阳离子脂质体基因转染技术将携带有HPV16-E6/E7DNA的真核表达质粒导入体外连续传20代的HPV阴性的Lscc-02喉鳞癌细胞系,采用PCR和Western blot检测HPV16-E6/E7基因在Lscc-02细胞系中的整合和表达。结果第22代和第35代细胞中,PCR和Western blot均分别检测出E6/E7基因和蛋白的存在,显示HPV16-E6/E7基因整合于Lscc-02细胞系中并能稳定表达。结论成功建立了表达HPV16-E6/E7基因的人喉鳞癌细胞系,为进一步研究HPV16-E6/E7基因在喉癌细胞中的作用机制以及喉癌的基因治疗奠定了基础。

多重PCR技术检测宫颈癌组织中HPV16、18和11/6E_6基因的研究

目的 :研究宫颈癌发病与 HPV16、18E6基因的关系。方法 :采用多重 PCR技术检测 83例宫颈癌组织中 HPV16、18及 11/ 6 E6基因。结果 :( 1)新疆地区 36例宫颈癌中 HPV E6基因检出率为 86 .11% ( 31/ 36 ) ,其中HPV16 E6占构成比 80 .5 6 % ( 2 5 / 31)。 ( 2 )山西地区宫颈癌中 HPV DNA阳性检出率 5 1.0 6 % ( 2 4/ 47) ,其中HPV16 E6占构成比 5 0 .0 0 % ( 12 / 2 4)。 ( 3)两组 HPV E6阳性检出率比较 P <0 .0 1,差异有显著性。两组 HPV16E6构成比比较 ,P >0 .0 5 ,差异无显著性。结论 :宫颈癌发生与 HPV感染的关系密切 ,且新疆地区比山西地区更为密切。两组 HPV感染以

p16^(INK4a)与HPV16/18-E6在宫颈组织中的表达及其临床意义

目的研究p16INK4a与HPV在不同宫颈组织中的表达及其临床意义,以寻求预测宫颈癌前病变及宫颈癌进展及预后的生物学标记。方法选取不同的宫颈组织,采用免疫组织化学方法检测宫颈组织上HPV16/18-E6和p16INK4a的表达,并结合临床资料进行分析。结果HPV16/18-E6和p16INK4a在正常宫颈组织、慢性宫颈炎组织和宫颈上皮内瘤变组织CIN I级上呈阴性表达或弱表达,在CINⅢ级和宫颈癌组织上表达明显增强(P<0.01)。p16INK4a在宫颈癌上的表达和宫颈癌的病理分化和肌层浸润程度有明显的相关性(P<0.01)。结论HPV16/18-E6和p16INK4a在宫颈CIN III和宫颈癌上的表达有明显的相关性。p16INK4a和HR-HPV联合检测可提高对宫颈癌前变及宫颈癌的早期诊断率。

HPV16/18E_6和P_(53)基因蛋白在喉鳞癌中的表达及其相关性研究

目的 探讨人乳头瘤病毒16 / 18型早期蛋白E6 (HPV16 / 18E6 )、P53基因蛋白在喉鳞癌(L SCC)中的表达及其相关性。方法 免疫组化SABC法检测HPV16 / 18E6 和P53基因蛋白在L SCC及声带息肉中的表达。结果 HPV16 / 18E6 在声带息肉中未见表达,在L SCC中的表达率为4 0 .0 % ,差异有显著性(P <0 .0 5 )。P53基因蛋白在声带息肉与L SCC中的表达率分别为6 .6 6 %和6 6 .2 % ,差异有显著性(P <0 .0 5 )。HPV16 / 18E6 及P53基因蛋白的表达与L SCC临床分期、淋巴结转移有关。二者的表达无明显相关性。结论 HPV 16 / 18型感染和P53基因异常与L SCC发生、发展有关。HPV16 / 18E6 与P53基因功能异常无明显相关性。

靶向HPV18E6基因siRNA对HeLa细胞p21、VEGF、Bax和Bcl-2基因的影响

目的探讨针对人乳头瘤病毒18型E6基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对宫颈癌HeLa细胞p21、VEGF、Bax和Bcl-2基因的影响。方法采用脂质体法将特异性siRNA瞬时转染HeLa细胞,半定量RT-PCR检测siRNA转染后HeLa细胞中p21、血管内皮生长因子(VEGF)、Bax和Bcl-2mR-NA的变化,免疫组化检测HeLa细胞中p21和VEGF蛋白的变化。结果RT-PCR检测结果显示转染后24、48、72hp21和BaxmRNA的表达与转染前比较均有升高。转染后24、48、72hVEGF和Bcl-2mRNA的表达与转染前比较均有降低。免疫组化检测结果显示转染后48、72hp21蛋白的表达与转染前比较均有升高。转染后48、72hVEGF蛋白的表达与转染前比较均有降低。结论靶向HPV18E6基因的siRNA可有效干扰宫颈癌HeLa细胞中p21、VEGF、Bax和Bcl-2基因的表达,从而抑制细胞增殖。

高危型人乳头瘤病毒HPV18 E6和E7基因的克隆与表达

目的:HPV18 E6和E7是两个病毒癌基因,存在于宫颈癌He La细胞中。采用双酶切和同源重组两种不同的策略克隆HPV18 E6、HPV18 E7和HPV18 E6-E7串联表达质粒,研究两者在细胞癌变中的作用。方法:首先,从He La细胞中提取RNA,RT-PCR获取E6和E7编码序列,分别用双酶切连接法或同源重组的方法连入不同载体质粒。然后,从He La细胞中提取DNA,PCR法扩增E6-E7编码序列,酶切连接法构建重组表达质粒。结果:经测序正确的质粒转染He La细胞,使用RT-PCR法或者Western-blot法检测目的基因转录与表达均显著升高。结论:HPV18 E6、E7和E6-E7三个表达质粒构建成功,均可在He La细胞中正确表达。

应用DNA芯片鉴定HPV18 E6-siRNA诱导HeLa细胞凋亡的分子机制

高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的E6基因在宫颈癌的发生中起关键作用,特异siRNA能有效抑制宫颈癌HeLa细胞内HPV18E6基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡.为进一步探讨HPV18E6-siRNA诱导HeLa细胞凋亡的分子机制,针对HPV18E6基因设计siRNA序列,利用人源U6启动子为模板,经PCR表达框架法体外扩增,转染宫颈癌HeLa细胞抑制HPV18E6基因表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡.对转染前后HeLa细胞总RNA样品进行荧光标记后,与Agilent Human1A寡核苷酸芯片杂交、扫描、数据分析及标准化处理,确定表达差异的基因并经荧光定量PCR对部分基因进行验证,结合PANTHER数据分析系统,将这些基因按照生物学功能进行归类,查阅GenBank数据库及相关文献,对其结果进行深入分析及讨论.在检测的18 716个基因和EST中,共筛出差异表达基因359个,其中307个基因表达上调,52个基因表达下调,主要包括细胞周期相关基因CCNG1、p21;凋亡相关基因CASP4、CASP6、IGFBP3、DFFA;泛素蛋白酶解途径相关基因E6-AP、UBE2C;角化细胞分化相关基因KRT4、KRT6E、KRT18;抑癌基因RECK、VHL等.研究结果表明,HPV18E6基因抑制引起的细胞凋亡效应主要是通过P53信号途径和泛素蛋白酶解信号途径调节细胞周期相关基因和凋亡相关基因的表达,从而抑制HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡.同时,抑癌基因的激活,角化细胞分化和免疫相关基因的表达上调,都说明了E6抑制后肿瘤细胞恶性转化程度的下降.

宫颈鳞状细胞癌及尖锐湿疣中HPV 16-E6、HPV16-E7蛋白的表达

使用免疫组化方法检测HPV16-E6、HPV16-E7蛋白在宫颈鳞状细胞癌及宫颈尖锐湿疣、外阴尖锐湿疣的情况，结果显示宫颈鳞状细胞癌、宫颈尖锐湿疣及外阴尖锐湿疣中HPV16-E6蛋白的表达分别为50％、0％、0％；HPV16-E7蛋白的表达分别为78.3％、68.4％、85.3％。宫颈鳞状细胞癌及尖锐湿疣中均有HPV16-E7蛋白表达，但同时发现低危型HPV感染中也表达HPV16-E7蛋白，原因尚须进一步研究。

高危型HPV-18E6引起小鼠骨髓源性树突细胞p53的磷酸化

目的 探讨高危型HPV-18E6对树突细胞中p53蛋白磷酸化的作用。方法 构建真核表达载体pGFP-18E6,转染小鼠骨髓源性的树突细胞,采用磷酸化的p53抗体免疫荧光化学染色,共聚焦显微镜下动态观察其表达水平。选用p53磷酸化位点的抗体（包括Ser6、Ser9、Ser15、Ser20、Ser37、Ser46和Ser392）对GFP-18E6融合蛋白表达的细胞进行免疫细胞化学染色,进一步探讨磷酸化的p53蛋白在转染后12-72 h的动态表达水平。结果 树突细胞在转染pGFP-18E6和p EGFP-C1质粒后,GFP-18E6主要定位于细胞核内,而对照组只表达GFP的蛋白则均匀分布于树突细胞。GFP-18E6诱导了p53蛋白的Ser15、Ser20和Ser392三个位点磷酸化。激光共聚焦显微镜测量细胞荧光强度显示,GFP-18E6的表达与时间有相关性。结论 高危型HPV-18E6可以诱导树突细胞的p53蛋白发生多个位点的磷酸化,包括Ser15、Ser20和Ser392,p53多个位点磷酸化是病毒宿主相互作用的一种机制。

HPV16-E6上调MIF对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

目的检测人乳头瘤病毒16型的致癌基因E6(HPV16-E6)通过巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用HPV16-E6过表达和干扰质粒转染能分泌MIF的人宫颈癌细胞C33A、Si Ha和Caski。Western blot和荧光定量PCR法检测MIF蛋白和m RNA表达,并用ELISA法检测培养上清液中MIF蛋白量;将转染后的宫颈癌细胞与人巨噬细胞非接触性共培养,检测巨噬细胞中MIF表达;C33A转染HPV16-E6后加或不加MIF抑制剂,CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖、周期和凋亡情况;采用Pearson相关分析法分析HPV16-E6和MIF间的关系、Kaplan-Meier分析HPV16-E6对患者生存率的影响。结果癌细胞、上清液和巨噬细胞中MIF表达随HPV16-E6表达而上调(P<0.05);HPV16-E6过表达可诱导C33A细胞增殖、减少G0/G1期细胞和抑制细胞凋亡;抑制MIF后,细胞增殖率下降、凋亡率增加(P<0.05);HPV16-E6表达与MIF正相关(P<0.05),Kaplan-Meier分析显示HPV16-E6表达与患者总生存率和无进展生存率有关(P<0.05)。结论 HPV16-E6可诱导宫颈癌细胞及其微环境中巨噬细胞MIF表达,并可通过MIF诱导宫颈癌细胞增殖和抑制细胞凋亡而影响宫颈癌的预后。

成都市58650名妇女宫颈人乳头状瘤病毒HPV6/11,HPV16/18感染状况研究

人类乳头状瘤病毒（HPV）是一种小分子双链DNA病毒,对人皮肤、黏膜有高度亲嗜性。目前,已经鉴定出的HPV约有150种亚型,根据其致病性大小分为低危型和高危型。低危型HPV6和HPV11致尖锐湿疣最主要的基因型,尖锐湿疣治愈后容易复发,随着病程迁延,复发次数增多,尖锐湿疣患者也可能导致癌变;高危型中的HPV16、18在世界范围内始终是引起宫颈癌变的最重要的亚型。

HPV18致癌基因E6选择性剪接在宫颈癌中的作用

[目的]探讨HPV18致癌基因E6选择性剪接在宫颈癌细胞中的潜在作用。[方法]HPV18感染或过表达HPV18致癌基因E6后,MTT法检测宫颈癌细胞C-33 A的增殖水平、逆转录PCR和琼脂糖凝胶电泳检测E6选择性剪接产物表达水平、免疫印迹检测E7蛋白表达水平。高通量测序HPV18感染或不感染的C-33 A细胞后调控E6选择性剪接的关键分子。[结果]过表达E6并感染HPV18的C-33 A细胞的增殖水平(2.35±0.37 vs 1.27±0.28)显著上升,且高于未过表达E6(1.27±0.28 vs 0.68±0.11)(P<0.05)。HPV18感染和过表达SRSF3后,选择性剪接产物E6*Ⅰ水平上升(0.25±0.03 vs 0.65±0.13)、E7蛋白表达水平(0.20±0.04 vs 0.77±0.18)上升。敲低SRSF3和过表达miR-1208时,C-33 A细胞的增殖水平(1.30±0.18 vs 0.65±0.13,1.75±0.27 vs 0.75±0.13)显著下降(P<0.05)。与只过表达E6相比,E6与SRSF3共表达、E6过表达同时干扰miR-1208均能够显著促进C-33 A细胞的增殖水平(0.65±0.13 vs 1.65±0.40,0.59±0.11 vs 1.70±0.24)(P<0.05)。敲低SRSF3后,选择性剪接产物E6*Ⅰ水平下降(0.15±0.02 vs 0.57±0.15)、E7蛋白表达水平下降(0.20±0.04 vs 0.77±0.18)(P<0.05)。干扰miR-1208后,选择性剪接产物E6*Ⅰ水平上升(1.12±0.25 vs 2.56±0.33)、SRSF3(0.15±0.03 vs 0.75±0.15)和E7蛋白表达水平上升(0.65±0.11 vs 0.98±0.20);过表达miR-1208后,选择性剪接产物E6*Ⅰ水平下降(1.85±0.34 vs 1.15±0.20)、SRSF3(1.33±0.14 vs 0.20±0.05)和E7蛋白表达水平下降(0.88±0.13 vs 0.50±0.10)(P<0.05)。此外,miR-1208靶向SRSF3 mRNA的3′端非编码区。[结论]miR-1208靶向SRSF3 mRNA的3′端非编码区并减少SRSF3的蛋白表达水平。SRSF3能够促进HPV18致癌基因E6的选择性剪接和E7蛋白的表达。HPV18感染后操纵miR-1208/SRSF3/E6/E7调控轴促进宫颈癌细胞的增殖。

HPV18E6基因对HeLa细胞PKR、eIF2α表达、激活及其生物学行为的影响

宫颈癌的发生与HPV感染相关，高危型HPV（high risk—HPV，HR—HPV）突破机体抗病毒的防御机制，在宫颈部位的整合感染是宫颈癌发生的始动因素和病理基础。