利用基因工程技术制备HPV58E7蛋白

目的利用基因工程技术制备HPV58E7蛋白。方法设计E7基因片段特异性PCR引物,以HPV58全基因组为模板,经PCR扩增E7基因片段,利用pGEX-4T3表达质粒,构建pGEX-4T3/HPV58E7重组体,转化BL21宿主细胞,IPTG诱导表达带有GST标签的可溶性融合蛋白。经谷胱甘肽凝胶柱亲和层析纯化,凝血酶切GST标签。结果 SDS-PAGE分析显示在分子量约为40KD处有新生蛋白条带,经凝血酶消化融合蛋白,所获纯化HPV58E7蛋白与预期理论值相吻合。结论利用带有GST标签的原核表达系统及其相应纯化策略,获得HPV58E7蛋白的高效制备。

人乳头瘤病毒58型E7基因重组真核表达质粒的构建与序列分析

目的:构建含人乳头瘤病毒58型(HPV58)E7基因的真核表达质粒,获得HPV58感染人后病毒基因结构的基本信息。方法:用HPV型特异性引物扩增出HPV58型E7 DNA,将HPV58 E7 DNA与PBS-T载体连接,获得克隆重组体HPV58 E7-PBS-T,经双酶切鉴定后,将E7基因与真核表达载体PCDNA3.1连接,然后经双酶切、测序鉴定,通过GenBank的数据库分析软件对HPV58型E7基因进行同源性分析。结果:双酶切重组DNA结果显示,重组体中HPV58型E7基因片段和载体DNA大小与预期计算一致,经BLAST比对,与GenBank数据库中的HPV58型E7基因序列具有高度的同源性,其中与1991年日本学者最早报道HPV58型E7基因相比,仅125位一个碱基的差异,即C-T的突变;推导相应的氨基酸由脯氨酸(pro)变为亮氨酸(leu)。结论:构建了含HPV58型E7基因的真核表达质粒,其基因序列与报道的基因序列高度同源,其微小差异对功能有无影响有待探讨。该重组质粒的构建为HPV58型E7基因及表达蛋白的功能研究奠定基础。

宁波地区妇女宫颈感染HPV58分布与变异谱系分析

目的了解宁波地区人乳头瘤病毒高危亚型HPV58的型别分布和癌相关基因E6、E7区基因变异谱系特征。方法收集调查社区和医院就诊妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV58亚型阳性株进行癌相关基因测序和序列分析。结果778例社区人群样本HPV58阳性16例,检出率2.06%,1 835例就诊人群样本HPV58阳性74例,检出率4.03%;HPV58病毒株E6、E7基因序列分别成功获得6和11条,E6区有2个位点发生碱基颠换:C307T和A388C,E7区有5个位点发生碱基颠换:G694A、T726C、T744G、G761A和T803C;系统进化树分析显示宁波地区HPV58变异株主要位于该亚型基因变异谱系A的A1和A2分支。结论宁波人群HPV58感染率较高,多数感染者携带病毒的癌相关基因发生变异,应加强对人群HPV感染及其持续感染状况的监测,尤其是HPV58阳性人群。