HRB2慢病毒表达质粒的构建核蛋白细胞内定位的研究

目的:构建重组HIV-1相关结合蛋白2(HIV-1rev binding protein2)基因的真核融合表达质粒plenti-GFP-HRB2,用慢病毒表达系统感染HEKTER细胞。对过表达GFP-HRB2基因的细胞在激光共聚焦显微镜下观察,研究HRB2蛋白在细胞中的分布规律。方法:Trizol法提取人睾丸组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物HRB2与克隆载体plp-GFP-C1连接、转化感受态细菌E.coliXLblue。测序正确后将质粒plp-GFP-HRB2与真核表达质粒plenti-C1分别进行双酶切,连接后转化。将构建正确的plenti-GFP-HRB2重组质粒、△8.91、pvsvg瞬时共转染293T细胞后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。收集包装病毒后感染HEKTER细胞。细胞生长一周后,将细胞铺玻片上用激光共聚焦显微镜观察。结果:构建的plenti-GFP-HRB2真核表达质粒经PCR鉴定及测序均说明人源HRB2基因已与plenti-GFP载体正确重组。瞬时转染293T细胞后能观察到绿色荧光。稳定感染后的HEKTER细胞经激光共聚焦显微镜观察后发现,HRB2蛋白在核仁处富集,在细胞核的其它部位少量分布,在胞浆中几乎没有分布。结论:人源HRB2基因表达的相关蛋白具有一个KH结构域,属于KH结构域家族的成员。稳定表达GFP-HRB2融合蛋白的细胞系的成功构建,为深入研究HRB2的入核机制、HRB2蛋白的在细胞分裂、RNA剪切等生物活动中的作用奠定了重要的实验基础。

HRB2基因对细胞增值影响的研究

目的:研究HRB2基因对细胞增值的影响。方法:设计4对HRB2 RNA寡核苷酸片段,经退火制备的双链DNA oligo,连接经双酶切的线性化PLKO.1-TRC-SP6载体上,转化后经PCR鉴定,阳性克隆测序,质粒抽提,应用Lipofectamine2000将质粒导入293T细胞,包装成慢病毒,再感染靶细胞293T,用嘌呤霉素筛选15天后,收集细胞抽提RNA,实时定量RT-PCR检测HRB2 mRNA水平,评价干扰效果。Western免疫印迹进一步确认有效作用靶点。通过划痕愈合实验和绘制生长曲线研究HRB2基因对细胞增值的影响。结果:载体构建成功。包装成慢病毒感染293T细胞系,发现:2号和4号靶点敲减HRB2基因效率达84%和88%。差别有统计学意义。通过western进一步证实了2号和4号是抑制HRB2的有效作用靶点。划痕愈合实验和绘制生长曲线的结果显示2号和4号靶点细胞株细胞生长受到抑制,并且4号较2号稍明显。结论:成功构建并筛选了携带有人HRB2基因的shRNA慢病毒载体及有效靶点,研究发现HRB2基因对细胞增值产生了影响,这为进一步研究HRB2的生物学功能提供了实验平台。

低钛高炉渣应用于HRB400E螺纹钢100t LF精炼的工业试验

采用喷吹CO_2法对低钛高炉渣进行脱硫处理,低钛高炉渣中硫的脱除率为66.59%~78.01%,渣中残硫含量为0.137%~0.283%,所制备的低硫低钛高炉渣中硫含量基本满足HRB400E钢LF精炼渣要求。低硫低钛高炉渣LF精炼终渣成分为/%:37.40~46.50CaO,12.30~15.10MgO,21.70~26.70SiO_2,5.74~17.00Al_2O_3,2.44~3.39TiO_2,0.36~1.42MnO,0.75~1.62Fe_2O_3,0.200~0.597S,钢水脱硫率为10.0%~41.5%,HRB400E钢终点[S]为0.008%~0.029%,与现工艺精炼渣(折渣和钢包渣终渣成分/%:34.30~42.90CaO,13.60~18.10MgO,24.00~26.50SiO_2,4.88~11.00Al_2O_3,0.71~1.12TiO_2,0.47~1.47MnO,0.81~1.72Fe_2O_3,0.245~1.132S)的脱硫效果相当(HRB400E钢终点[S]0.027%~0.032%)。