植物病原细菌的hrp基因

hrp基因存在于4类革兰氏阴性植物病原细菌中,决定病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病植物过敏性反应。从hrp基因簇,hrp基因avr基因的关系,hrp基因的编码产物harpin蛋白,hrp基因调控与功能以及hrp基因参与植物-细菌互作等几个方面,较为详细地阐述了当前植物病原细菌hrp基因的研究状况,并分析了hrp基因未来研究的趋势。

水稻条斑病细菌hrp基因诱导表达系统的建立

水稻条斑病细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response)和在寄主水稻上具致病性(pathogenicity)的hrp基因簇是诱导表达的。为研究hrp基因的功能,利用hpa1和hrpX基因的启动子与gfp基因进行融合,构建了hrp基因诱导表达系统。绿色荧光蛋白表达揭示,Xooc的hrp基因在营养丰富的NB培养基上不能有效表达,在hrp诱导培养基XOM3上可有效表达。以hrpX和hrpG突变体为参照,RT-PCR研究结果提示,Xooc野生型菌株hpa1基因在NB上不能有效表达,在XOM3培养基上可有效表达。相应地,hrpX突变体中hpa1基因不能被诱导表达,而在hrpG突变体中hpa1基因转录表达水平低于野生菌。研究结果还证实,水稻悬浮细胞能高效诱导Xooc的hrp基因表达。Xooc hrp基因诱导表达系统的建立为研究hrp基因功能、发掘T3SS效应分子以及开展Xooc致病性研究奠定了基础。

野油菜黄单胞菌8004菌株hrp基因簇侧翼序列大片段缺失突变体的构建及表型分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X anthom onas camp estris pv.camp estris,简称X cc),是一类能在全球范围引起十字花科植物黑腐病的γ-变形菌纲细菌。该菌有一个长41.7 kb的H rp致病岛,包含41个开放阅读框(ORF)。H rp致病岛5′端边界为IS1479插入元件,3′端边界为IS1595插入元件。G+C含量为62.3%,明显低于全基因组64.9%的G+C含量。根据基因类型,将该致病岛分为三个区段:位于致病岛中心区的hrp基因簇、及其左侧翼的假定基因区段(HGR)和右侧翼的降解酶类基因区段(EGR)。HGR长7.4 kb,注释蛋白编码基因6个,全部为功能未知的假定基因。EGR长9.3 kb,注释蛋白编码基因8个,其中6个为降解酶类基因。为了鉴定hrp基因簇侧翼序列的功能,采用标记置换的突变方法,将X cc 8004的hrp基因簇右侧翼EGR片段缺失。该突变体8004ΔR对寄主植物的致病力比野生型菌株显著降低,而在非寄主植物辣椒ECW-10R上仍能引起过敏反应。该突变体其它的致病相关生化因子,如胞外多糖产量和胞外酶的活力均未受明显影响。实验结果表明EGR区段的缺失不影响三型分泌系统的正常功能,也不影响该菌在基本培养基上的生长,但使X cc的致病力明显降低,提示X cc 8004菌株hrp基因簇右侧翼序列中存在与致病相关的基因。

植物病原细菌hrp基因研究进展

hrp基因决定植物病原细菌对寄主植物致病性和诱导非寄主及抗病寄主过敏性反应 ,hrp基因在植物和动物病原细菌中具有同源性 ,编码产物具有HR的激发子、调节和组成Ⅲ型泌出系统等功能 ,hrpM是P syringae合成 β (1 ,2 ) 葡聚糖必需的 ,除了Avr蛋白和harpins外致病性或毒性蛋白也可从Hrp系统泌出 。

青枯菌hrp基因的研究进展

青枯菌的hrp基因可诱发植物的超敏反应。对其基因组全序列测定表明:hrp基因簇位于基因组的大质粒上,共有20多个基因组成。从青枯菌中分离得到的可直接诱发植物超敏反应的效应蛋白主要为pop基因编码,它由hrp基因编码的类型III蛋白分泌通道释放。目前的研究表明:(1)在hrp基因簇中,hrpY、hrpX及hrpV与分泌通道的一种纤毛的组装有关;(2)hrpB是整个类型III蛋白分泌通道基因的转录激活子并作用于基因组中的其它效应基因;(3)hrpG是植物信号对hrp基因的表达进行级联调控的组分之一。

Wun1启动子Me13'非转录区的克隆及Hrp基因植物表达载体的构建

采用PCR技术,分别从马铃薯、金花菊基因组DNA中扩增到了马铃薯损伤诱导启动子Wun 1,和对启动子活性有显著增强作用的Me1 3 非转录区。经序列同源性分析表明,马铃薯损伤诱导启动子Wun 1与已知序列的同源性为96.86 %,Me1 3 非转录区的同源性达99 %。得到的Wun 1克隆与原序列有一定的差异,尤其在735～768处差异较大,为一新颖的启动子,现已注册到分子生物学GenBank数据库(GenBank, gi: AY485646)。利用来自欧文氏梨火疫病菌的Hrp基因与克隆的Wun 1启动子和Me1 3 非转录区构建了Wun 1-Hrp-Me1 3 植物表达载体pBI WHM,同时构建了CaMV 35S-Hrp-Me1 3 植物表达载体pBI HM,为下一步鉴定Wun 1启动子和Me1 3 增强子对Hrp基因表达活性的影响及通过遗传转化培育植物抗病品种奠定了基础。

植物病原细菌hrp基因簇比较基因组分析

hrp基因是植物病原细菌中一类重要的致病基因,一般成簇排列。对14种已完成全基因组测序的植物病原细菌基因组中的hrp基因簇进行了大小、G+C含量、基因组成的BlastP比较。发现它们的大小在18～24 kb,由22～28个基因组成。欧文氏菌属和假单胞菌属的菌株中G+C含量较低,拉尔氏菌属和黄单胞菌属菌株的G+C含量较高。而且,各菌属的基因簇都有其独有的hrp基因,如假单胞菌属是hrpK1、hrpV、hrpA;欧文氏菌属是hrpT、hrpV、hrpA;拉尔氏菌属是hrpZ、hrpX、hrpY、hrpV;黄单胞菌属是hrpE、hrpD6、hpaA。其中,基因hrpA1、hrpA、hrpY和hrpE在假单胞菌属、欧文氏菌属、拉尔氏菌属和黄单胞菌属中均编码Ⅲ型菌毛的基因,可能在寄主和病原物识别中起重要作用。

含hrp基因生物诱抗剂对棉花黄萎病调控作用研究

2001～2003年对两种含hrp基因的生物工程制剂Messenger和伊力特进行了田间控制棉花黄萎病危害的药效试验,调查并分析了其对棉花生长和产量的调控作用。通过平板对峙反应和毒素敏感性测定,Messenger和伊力特对棉花黄萎病菌无抑制作用,但对棉花具有诱导抗性作用。田间试验结果表明,在棉花不同生育期,Messenger和伊力特对棉花黄萎病均表现出一定的控制作用,其中播种到初花期伊力特控制效果最好,防效为51.69%,高出对照药剂28.26%。在棉花初花期前,伊力特、Messenger对供试棉花品种的生长势影响较大,尤其伊力特处理的小区产量明显高出清水对照487.50kg/hm2,增产21.26%。

hrp基因突变体Du728诱导水稻抗白叶枯病的机制研究

以水稻白叶枯病菌野生型菌株JXOⅢ和其hrp基因突变体Du72 8接种处理汕优 6 3幼苗 ,测定了处理的第 3叶和同株未处理的第 4叶中水杨酸 (SA)含量以及苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、过氧化物酶 (PO)和几丁质酶 (CHT)活性及其相应基因转录活性的变化。接种JXOⅢ和Du72 8后 ,处理叶片和未处理叶片中游离SA含量几乎没有变化 ,而根中游离SA含量则明显增加。与JXOⅢ处理相比 ,Du72 8处理后可迅速提高处理叶片中PAL、PO和CHT的活性 ,而未处理叶片中这些酶的活性几乎没有变化。处理和未处理叶片中编码这些酶的相应基因 (包括查尔酮合成酶基因 )转录活性的时序变化与酶活性的变化一致。这些结果表明Du72 8处理后不能诱导SA在处理和未处理叶片中的积累 ,处理叶片对白叶枯病的诱导抗性可能与这些基因的快速和高强度的协同表达有关 。

含hrp基因的克隆片段在水稻白叶枯病菌不同小种中的功能和同源性

将从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae Dye,简称Xco)小种3菌株JXOⅢ中克隆的hrp基因片段(pNAX3103),用三亲交配法向病菌其它小种及其毒性基因突变体转移,结果表明pNAX3103可以进入其它小种,但对不同小种毒性基因突变体的转移能力则不同。功能互补分析表明;该hrp基因片段在不同小种中对病菌的生长,以及蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的产生和分泌无明显影响;在野生型菌株中能增加亲本菌株对水稻品种IR26的致病力(JXO Ⅰ)或亲和性(JXO Ⅴ),对于毒性基因突变体,pNAX3103虽能进入JXO Ⅰ经Tn5诱变的毒性基因突变体XcoMll07,但不能恢复其致病性和淀粉酶阴性反应。用hrp基因片段作为探针,对10个来源不同的小种或菌系群进行DNA同源性分析,结果与所有Xco菌株都有明显的同源性杂交带,但杂交带型不同,与甘蓝黑腐病菌、水稻细菌性条斑病菌、柑桔溃疡病菌、大白菜。软腐病菌的DNA有同源杂交带,但与水稻基腐病菌DNA无同源性。

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个XooTn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。

干旱胁迫下沙棘脯氨酸含量及HrP5CS基因表达分析

筛选中国沙棘全长转录组数据中差异表达的HrP5CS基因,对其进行生物信息学分析和不同胁迫下各部位表达模式的研究,同时测量叶中脯氨酸的含量。结果表明:HrP5CS基因全长为2127 bp,编码708个氨基酸,不含信号肽,无跨膜结构的稳定疏水蛋白。与30个同源序列比对表明,氨基酸长度、理论等电点和分子质量相近;聚类分析表明,P5CS蛋白存在明显科属特性,在同科不同属内亲缘性较近;多重序列比较中,中国沙棘HrP5CS与酸枣(Ziziphus jujuba var.spinosa)亲缘性最近且序列一致性最高。荧光定量结果表明,HrP5CS基因在中国沙棘各部位特异性表达,在根和叶中总体呈上升状态,复水后下降至正常水平,在茎中第2天达到最高值后持续下降至最低值,复水后回到正常水平。脯氨酸含量随着干旱胁迫时间的持续呈阶梯式上升趋势,SPSS皮尔森相关系数分析表明,根和茎中的HrP5CS基因表达量与叶中脯氨酸含量呈正相关关系,而在叶中则呈负相关关系。以上结果说明HrP5CS基因表达和脯氨酸的积累对中国沙棘抗旱具有重要意义。

植物病原细菌hrp基因研究现状和展望

从ｈｒｐ（过敏性反应和致病性）基因簇，ＤＮＡ序列的同源性，基因表达调控与ａｖｒ基因（无毒基因）的关系和基因的功能等几个方面较为详细地综述了植物病原细菌ｈｒｐ基因的研究现状，并分析了ｈｒｐ基因研究的未来趋势。

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。

十字花科黑腐病菌hrp基因致病功能分析

通过对Xcc 8004菌株的hrp基因进行逐一敲除,系统研究单个hrp基因对Xcc致病性的贡献。结果表明,9个hrc(hypersensitive response and conserved)基因单独突变后在满身红萝卜上的致病性和在辣椒ECW-10R上激发HR的能力完全丧失;9个hrp基因中,hrpW突变后在辣椒ECW-10R上仍能产生HR,满身红萝卜上致病性减弱,其余hrp基因突变后致病性和过敏反应均丧失;4个hpa(hrp associated protein)基因突变后,hpaA和hpaB突变体完全丧失在满身红萝卜上的毒性也不能在辣椒ECW-10R上引起HR,hpa1和hpaP突变后致病性和HR显著减弱。另外,通过RT-PCR对Xcc 8004 hrp基因簇的每个基因受hrpX和hrpG的调控情况进行分析,结果表明所有hrp基因在不同程度上都受到hrpG、hrpX的正向调控。

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpG的鉴定及其变异分析

根据水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)hrp基因的序列设计引物,通过PCR方法从水稻白叶枯病菌JXOIII和PXO99A菌株中扩增得到核苷酸序列完全一致的hrp基因,以该基因为探针与JXOIII／pUFR034基因组文库中含有hrpX克隆pUHRX245(36.8kb)的4个亚克隆进行southern blot分子杂交,确定在亚克隆pB1中1.3 kb大小的片段和AE4(3.0kb)片段中存在hrpG同源序列.测序结果表明,在pB1中有586个碱基序列,在AE4中有206个碱基,共同构成完整的hrpG基因,且与已知的hrpX基因是毗邻的.以同样方法从水稻白叶枯病菌PXO99A菌株的hrp-突变体M16中扩增得到hrpG基因对应位置的同源突变序列.序列分析表明其有意义突变为541位的C→T的突变,从而导致亮氨酸变为苯丙氨酸(Leu→Phe).将hrpg基因和突变序列分别导入突变体M16中,转移结合子M16/hrpG(PXO99A)恢复了其在烟草上的过敏反应和在水稻上的致病性,而突变序列的结合子M16／hrpG(M16)则不能使其恢复功能,从而确定M16是由于单个碱基的突变所引起的功能突变.经过对基因及其产物的比对发现,对于第Ⅱ组hrp调节基因hrpG的变异,种间变化明显高于种内不同致病变种的变化.

水稻条斑病细菌hrp调节基因hrpG_(Xooc)和hrpXooc的克隆和序列分析

Xanthomonasoryzaepv.oryzicola基因文库的hrp基因克隆pUHRS138携 39.3 kb大小的hrp基因片段。经系列亚克隆和对hrp 突变体的功能互补验证 ,4 .5 kbBamHI KpnI为最小功能片段 ,该片段可使X .o .pv .oryzicola的hrp 突变体恢复在烟草上激发产生HR和在水稻上具致病性。序列测定和分析显示 ,4 .5 kbhrp片段中含hrpXooc和hrpGXooc基因。单独的hrpGXooc和hrpXooc不能功能互补hrp 突变体。hrpXooc与其它黄单胞菌中已克隆的hrpX的同一性达 83%以上 ,推测的蛋白质水平上的差别主要在32、14 1、16 4、175、2 13、2 4 7和 35 7位点上。HrpX序列中α 螺旋 转 α 螺旋结构在黄单胞菌中高度保守。hrpGXooc与水稻白叶枯病菌的hrpGXoo同一性达 96 % ,与X .campestrispv.vesicatoria的hrpGXcv同一性达 87% ,与Ralstoniasolanacearum的hrpGRs同源性较低 ,4种HrpG蛋白质水平上的差别主要集中在 2 2、2 9、115和 2 5 2位点上。HrpGXooc和HrpGXcv同列比较显示 ,3～ 9和 2 16～ 2 2 0区域的氨基酸序列有所不同 ,可能反映了HrpG蛋白在感知环境信号和调节hrp基因表达方面的差别。

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4

恶性疟原虫反义HRPⅡ基因荧光真核表达重组质粒的构建

目的 构建恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ (Histidine richproteinⅡ ,HRPⅡ )反义真核表达载体 ,为研究HRPⅡ反义核酸的抗疟作用奠定基础。方法 应用基因重组技术 ,将我们已经克隆的恶性疟原虫HRPⅡ基因从HRPⅡ /pUC19反向亚克隆入荧光真核表达载体pEGFP N3,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌 ,阳性重组子经HindⅢ和SacⅠ双酶切分析、PCR鉴定。结果 恶性疟原虫HRPⅡ基因从HRPⅡ /pUC19重组质粒中 ,成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP N3,获得了反义HRPⅡ /pUC19重组质粒。结论 恶性疟原虫HRPⅡ基因以反方向亚克隆入pEGFP N3质粒 ,成功构建反义HRPⅡ /pEGFP N3荧光真核表达载体 ,解决了HRPⅡ反义核酸来源问题 ,为下一步研究反义HPRⅡ的抗疟作用奠定了基础。