眼镜蛇毒细胞毒素-1的分离纯化及其对HSC-LX2细胞PI3K/AKT 信号通路的影响

肝纤维化是多种刺激诱导的肝脏反复损伤的一种病理再生反应[1],其主要表征是肝脏中沉积着过量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。ECM产生主要原因之一是由于肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)被大量激活分化,磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路是一条重要的细胞内信号通路,能通过影响HSC的增殖和凋亡来调节肝纤维化[2-4]。

原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的抑制作用及机制研究

目的:考察原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的抑制作用,并对其机制进行初步探讨。方法:采用MTT法测定25、50、100、200、400、500μmol/L原阿片碱作用24 h对HSC-LX2细胞增殖的影响,计算细胞增殖抑制率。另取HSC-LX2细胞分为对照组(含5%胎牛血清的1640培养基)和原阿片碱低、中、高浓度组(100、200、400μmol/L),作用24 h后,流式细胞术测定细胞凋亡率;荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)mRNA的相对表达量,Western blot法测定细胞中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-2蛋白的相对表达量。结果:25、50、100、200、400、500μmol/L原阿片碱对HSC-LX2细胞的增殖抑制率分别为0、6.9%、18.7%、34.2%、48.9%、53.9%。与对照组比较,原阿片碱低、中、高浓度组细胞中CollagenⅠ、TIMP-1 mRNA相对表达量和α-SMA蛋白相对表达量均显著降低,MMP-2蛋白相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);原阿片碱中、高浓度组细胞的凋亡率和MMP-2 mRNA相对表达量显著升高,α-SMA、CollagenⅢmRNA相对表达量和CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白相对表达量均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:原阿片碱可抑制HSC-LX2细胞增殖,诱导其凋亡,可降低α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1表达,升高MMP-2表达有关。

鳖甲煎丸对AngⅡ-ROS诱导下HSC-LX2细胞中PKC-Pyk2/SRC通路的影响

[目的]探讨鳖甲煎丸含药血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)作用下HSC-LX2细胞中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)-富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)/SRC通路的影响。[方法]以人源肝星状细胞HSC-LX2为研究对象,以AngⅡ诱导产生ROS,再以鳖甲煎丸含药血清进行干预,以MTT法检测HSC-LX2细胞的增殖情况,荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS含量,Western blot检测PKC、Pyk2、SRC蛋白表达情况。[结果] MTT结果显示,与AngⅡ组比较,5%鳖甲煎丸含药血清培养24h后,鳖甲煎丸高、中剂量组显著抑制HSC-LX2细胞增殖(P<0.05,P<0.01);培养48h后,鳖甲煎丸高、中、低剂量组均能显著抑制HSC-LX2细胞增殖(P<0.05,P<0.05,P<0.01);培养72h后,中剂量组有显著抑制效果(P<0.01)。此外,除了15%中剂量鳖甲煎丸含药血清培养48h后有显著抑制效果(P<0.05),其余各组、各时间段均无明显抑制作用,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光探针DCFH-DA结果显示,与空白对照组比较,AngⅡ组ROS产生明显增多,经鳖甲煎丸含药血清高、中剂量组干预后,ROS均不同程度减少。Western blot显示,鳖甲煎丸含药血清干预后,PKC(P<0.001,P<0.001,P<0.001)、Pyk2(P<0.05,P<0.001,P<0.001)、SRC(P<0.001,P<0.001,P<0.01)蛋白表达均受到显著抑制。[结论] HSC-LX2细胞经AngⅡ刺激后可以产生ROS,且细胞增殖明显,此过程与PKC、Pyk2、SRC蛋白的激活有关。鳖甲煎丸可通过减少ROS的产生来阻止HSC-LX2细胞的增殖,其机制与抑制PKC、Pyk2、SRC蛋白的表达有关。

合欢皮-白蒺藜药对对AngⅡ-ROS诱导下HSC-LX2细胞增殖及PKC/Nrf2/HO-1通路的影响

[目的]探讨合欢皮-白蒺藜含药血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)作用下人源性肝星状细胞HSC-LX2的增殖及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)/核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)/血红素氧化酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)通路的影响。[方法]以HSC-LX2细胞为研究对象,先以AngⅡ诱导产生ROS,再以合欢皮-白蒺藜含药血清进行干预,MTT法检测HSC-LX2细胞的增殖情况,Western blot和Real-time PCR检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、PKC、Nrf2、HO-1蛋白以及m RNA表达情况。[结果]MTT结果显示,与AngⅡ组比较,合欢皮-白蒺藜药对高、中、低剂量组均显著抑制HSC-LX2细胞增殖(均P<0.05)。Western blot结果显示,与AngⅡ组比较,合欢皮-白蒺藜药对高、中、低剂量组α-SMA蛋白表达减少(均P<0.001),低剂量组PKC蛋白表达减少(P<0.05),高、中剂量组Nrf2蛋白表达减少(P<0.001,P<0.01),高、中剂量组HO-1蛋白表达减少(P<0.001,P<0.001)。Real-time PCR结果显示,与AngⅡ组比较,合欢皮-白蒺藜药对高、中、低剂量组α-SMA mRNA表达减少(P<0.01,P<0.001,P<0.001),PKC mRNA表达减少(均P<0.001),Nrf2 mRNA表达减少(P<0.001,P<0.001,P<0.05),高、中剂量组HO-1 mRNA表达减少(均P<0.001)。[结论]HSC-LX2细胞经AngⅡ刺激后增殖活化明显,且α-SMA表达升高,此过程与PKC、Nrf2、HO-1蛋白的激活有关。合欢皮-白蒺藜可通过抑制HSC-LX2细胞增殖来阻止肝纤维化,其机制与抑制PKC、Nrf2、HO-1的表达有关。

敲低HSC-LX2人肝星状细胞钙网蛋白引起细胞内Ca^(2+)水平升高并促进细胞凋亡

目的探讨沉默钙网蛋白(CALR)基因对人肝星状细胞(HSC-LX2)凋亡及细胞内Ca^(2+)水平的影响.方法设计靶向CALR的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染至HSC-LX2细胞,筛选出敲低CALR的HSC-LX2细胞.采用异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡,Fluo 3-AM钙离子荧光探针负载结合激光共聚焦显微镜观察细胞内Ca^(2+)浓度变化,反转录PCR检测细胞CALR、B细胞淋巴瘤分子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)的mRNA水平,Western blot法检测CALR、BAX、Bcl2蛋白表达.结果敲低HSC-LX2细胞CALR后,细胞凋亡率显著增加,Ca^(2+)浓度也有明显升高,BAX的表达显著增加,Bcl2表达明显降低,且BAX/Bcl2比值显著升高.结论敲低HSC-LX2细胞CALR的表达会增加细胞Ca^(2+)水平,上调BAX/Bcl2的比值,促进细胞凋亡.

乌索酸体外通过激活Nrf2信号通路抑制人肝星状细胞的增殖和细胞外基质相关基因的表达

目的乌索酸(Ursolic acid,UA)具有抗肝纤维化作用,但是其机制尚不完全清楚。由于肝纤维化与氧化应激有关,因此本文通过对乌索酸抗氧化作用的研究以阐释其抗肝纤维化机制。方法实验用实时定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)法和Western blot法检测氧化应激状态下LX2中α平滑肌肌动蛋白(alpha muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagen type I,COL1A1)、Ⅲ型胶原(collagen type Ⅲ,COL3A1)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 2,MMP2)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)mRNA和蛋白表达的变化以及UA对这些变化的影响;通过测定还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量以观察UA的抗氧化作用,并检测了核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)及其下游基因血红素加氧酶(heme oxygenase 1,HO1)蛋白表达的变化,探察UA抗肝纤维化作用的可能机制。结果实验结果显示H2O2可引起LX2的活化和氧化应激,使细胞中的ECM mRNA表达增加。UA可抑制LX2的活化,减少细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的表达,显著升高GSH含量,降低MDA含量,并增加Nrf2的转核和HO1的表达。结论实验结果提示UA通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用从而抑制LX2的活化和ECM的产生。

基于网络药理学探究合欢皮-白蒺藜药对抑制肝星状细胞系LX2的抗焦亡作用

基于网络药理学、分子对接技术和体外实验验证探讨合欢皮-白蒺藜药对对肝星状细胞系(HSC)-LX2焦亡及肝纤维化的影响。在网络药理学中,通过在线数据库和中国知网获取合欢皮、白蒺藜以及肝纤维化的相关靶点,构建“药物-成分-靶点”网络和“药物-成分-靶点-疾病”网络,使用STRING数据库构建蛋白互作网络,采用Metascape数据库进行GO和KEGG数据分析,预测合欢皮-白蒺藜药对治疗肝纤维化的作用机制,并采用分子对接技术对网络药理学部分结果进行初步验证,再进一步结合体外实验验证上述结论并深入研究。从网络药理学分析结果可知,合欢皮-白蒺藜药对有25个有效成分和439个靶点,与肝纤维化共同靶点152个,涉及NLRP3和caspase-1等。KEGG通路富集分析得到194条信号通路,其中NOD样受体信号通路位于前列,结合共同靶点与细胞焦亡有关。体外实验结果显示,合欢皮-白蒺藜药对的含药血清能够降低HSC-LX2的增殖率以及ROS、IL-18和IL-1β含量(P<0.05)。Western blot和qRT-PCR结果显示,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激后HSC-LX2中NLRP3、caspase-1、α-SMA及GSDMD蛋白和基因表达升高,合欢皮-白蒺藜药对的含药血清干预后表达下降(P<0.05)。综上,合欢皮-白蒺藜药对的含药血清可抑制细胞焦亡的经典通路,该机制可能参与其抗肝纤维化作用,具体机制有待后续进一步研究。这与网络药理学预测的结果相符。

白花丹醌对人肝星状细胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影响

目的:研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4)的mRNA和蛋白表达、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。方法:体外培养HSC-LX2,随机设立空白组、TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1+plumbagin(2μmol/L、1.5μmol/L及1μmol/L)组;细胞与各药物共同孵育72 h后,采用RT-PCR检测细胞Nox4 mRNA的表达;原位装载探针法测定细胞内ROS的水平;Western blot检测细胞内Nox4和α-SMA的蛋白含量。结果:与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,2μmol/L和1.5μmol/L plumbagin能明显降低HSC-LX2细胞Nox4 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),下调ROS水平,降低α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。结论:Plumbagin可能是通过下调Nox4的表达进而降低ROS生成从而发挥其抑制HSC-LX2细胞活化的作用。

逍遥散保护受损肝细胞和抗肝纤维化的作用机理研究

目的探讨逍遥散保护受损肝细胞和抗肝纤维化的作用机制。方法观察不同浓度的逍遥散对CCI4诱导的肝细胞（HL7702）损伤模型及HSC—LX2细胞0D值，ALT，AST，SOD，MDA，LDH，Hyp和TIMP-1的影响。结果0．008-0．200mg·ml^-1逍遥散治疗组的OD值，SOD活力，ALT，AST，LDH，MDA含量，与模型对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）；0．200，0．040mg·ml^-1逍遥散组的OD值、Hyp、TIMP-1含量与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论逍遥散通过提高SOD活性，降低ALT，AST，LDH，MDA含量保护受损的肝细胞，通过抑制肝星形细胞增殖，降低上清液中Hyp和TIMP-1的含量起到抗肝纤维化的作用。

白花丹醌对TGF-β_1刺激人肝星状细胞α-SMA表达的影响

目的:研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞HSC-LX2α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白表达的影响。方法:体外培养HSC-LX2,随机设立空白组,TGF-β1刺激的模型组,TGF-β1+白花丹醌2.0μmol·L-1高剂量组,TGF-β1+白花丹醌1.5μmol·L-1中剂量组和TGF-β1+白花丹醌1.0μmol·L-1低剂量组,各药物与细胞孵育72 h后,采用RT-PCR检测各组HSC-LX2α-SMA mRNA的表达,采用免疫细胞化学方法(ICC)检测HSCLX2中α-SMA蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组α-SMA mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,高、中剂量组HSC-LX2细胞中α-SMA mRNA的表达明显降低(P<0.01);免疫细胞化学结果显示白花丹醌高、中剂量组对HSC-LX2细胞α-SMA蛋白的表达有显著地抑制作用(P<0.05),尤以高剂量组更明显(P<0.01)。结论:白花丹醌能抑制HSC-LX2的活化和增殖,其机制之一可能是从mRNA水平和蛋白水平抑制α-SMA的表达,从而发挥其抗肝纤维化作用。