牛蒡子苷元调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究牛蒡子苷元(ARC)通过调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌(OSCC)HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其机制。方法:使用不同质量浓度的ARC处理人HSC-3细胞,CCK-8法检测ARC对细胞增殖活力的影响,以选择适宜的药物浓度。将HSC-3细胞分为对照组、ARC-L组(10 mg/L ARC)、ARC-M组(20 mg/L ARC)、ARC-H组(40 mg/L ARC)和ARC-H+Jagged1/FC组(40 mg/L ARC+1.2μg/mL Jagged1/FC)。采用EdU法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞的迁移、侵袭能力及细胞周期和细胞凋亡率,WB法检测增殖(c-Myc、cyclin D1)、凋亡(BAX、Bcl-2、survivin)、EMT(E-cadherin、vimentin、Snail)及Notch/Hes-1通路(Notch 1、Hes-1、NICD)相关蛋白的表达水平。结果:与0 mg/L相比,10~80 mg/L的ARC均能显著降低HSC-3细胞增殖活力(均P<0.05)。与对照组相比,ARC-L组、ARC-M组和ARC-H组HSC-3细胞EdU阳性率、划痕愈合率、侵袭细胞数、S期和G2/M期细胞占比及c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、survivin、vimentin、Snail、Notch 1、Hes-1和NICD蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率、G0/G1期细胞占比及BAX、E-cadherin的蛋白表达均显著升高(均P<0.05),且呈浓度梯度依赖性。同时使用Notch激动剂Jagged1/FC,则可部分逆转ARC对HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的作用(均P<0.05)。结论:ARC可能通过抑制Notch/Hes-1信号通路抑制OSCC细胞HSC-3增殖和侵袭并促进细胞凋亡。

CRISPR/Cas9构建TGFBI稳定敲除HSC-3细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除人口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞系HSC-3中的TGFBI基因。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对于TGFBI外显子3上下游的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),并以PX330质粒为骨架构建能表达此sgRNA的真核重组质粒。将此质粒以及PGK-puro质粒共转染HSC-3细胞,用嘌呤霉素抗性筛选细胞克隆,并用PCR、核酸电泳和测序初步确定基因敲除情况,再通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法确认细胞中TGFBI的mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果通过CRISPR/Cas9技术,HSC-3中的TGFBI基因外显子3的核苷酸序列已被完全敲除。免疫印迹法检测显示,相对于HSC-3,TGFBI敲除细胞中无法检测到TGFBI蛋白的表达。同时,通过RT-q PCR对部分基因进行检测,发现一系列与细胞周期和上皮间充质转化相关基因表达发生了改变(P<0.05)。结论通过CRISPR/Cas9技术成功获得了TGFBI基因敲除的HSC-3细胞系,为进一步研究TGFBI在OSCC中的作用及其机制提供了理论基础。

敲低SPP1通过PI3K/AKT信号通路促进HSC-3细胞凋亡

为研究敲低分泌型磷蛋白1(SPP1)基因对人口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞株HSC-3细胞凋亡的影响,本研究从基因表达综合(GEO)数据库下载表达谱芯片数据GSE31056,用Bioconductor中的Limma包筛选差异表达基因。利用靶向设计并构建SPP1重组质粒载体,转染HSC-3细胞,Real-time PCR和Western blotting分别检测SPP1基因和蛋白表达情况,细胞流式术检测凋亡率,Western blotting检测PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平。筛选出的差异表达基因中SPP1在OSCC中高表达。敲低SPP1后其基因和蛋白表达水平明显下降,细胞凋亡率明显增加,PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平下降。敲低SPP1通过PI3K/AKT信号通路促进OSCC HSC-3细胞凋亡。

苦丁茶黄酮通过caspases活化诱导人HSC-3口腔癌细胞凋亡的效果

本研究对苦丁茶黄酮通过caspases(半胱氨酸蛋白酶蛋白)活化诱导人HSC-3口腔癌细胞凋亡的效果进行了观察。通过MTT实验发现在0~150μg/m L浓度下,苦丁茶黄酮可以抑制HSC-3癌细胞的生长,但不影响HOK口腔角质细胞(正常细胞)的增殖。150μg/m L浓度下苦丁茶黄酮对HSC-3癌细胞的生长抑制率(78.9%)超过同浓度下市售大豆异黄酮胶囊物(42.8%)。通过检测癌细胞的m RNA表达强度发现,相对于对照癌细胞,苦丁茶黄酮可以上调HSC-3癌细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax(Bcl-2相关X蛋白)、Fas(凋亡相关因子)和Fas L(凋亡相关因子配体)的表达,下调Bcl(B淋巴细胞瘤)-2、Bcl-x L、c IAP(细胞凋亡抑制蛋白)-1和c IAP-2的表达,并且随着苦丁茶黄酮浓度的升高,这些趋势进一步加强。实验结果证实苦丁茶黄酮可以在体外通过caspases的活化实现诱导HSC-3癌细胞凋亡的效果。

shRNA干扰RACK1表达增强口腔鳞癌细胞放射敏感性的研究

目的探讨下调RACK1基因表达对口腔鳞癌细胞生长及放射敏感性的影响。方法构建RACK1基因的shRNA载体,通过脂质体转染技术将其转入口腔鳞癌HSC-3细胞,G418筛选得到稳定转染细胞。荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测细胞中RACK1mRNA和RACK1蛋白表达水平;CCK8实验检测细胞生长能力;流式细胞仪检测细胞凋亡;细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭能力;克隆形成实验检测下调RACK1表达联合X射线照射对细胞增殖能力的影响。构建裸鼠移植瘤模型,观察下调RACK1基因表达联合X射线照射对口腔鳞癌的生长抑制作用。结果RT-PCR和Western blot结果显示转染后HSC-3细胞RACK1mRNA相对表达量明显降低(P<0.05),RACK1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。CCK8实验结果显示下调RACK1表达可抑制HSC-3细胞生长(P<0.05),联合X射线照射使细胞凋亡率明显升高(P<0.05),外侵袭穿透细胞数显著减少(P<0.05)。克隆形成实验结果显示shRACK1组的存活分数低于对照组,放射增敏比为1.37(D0值比)。裸鼠移植瘤实验显示shRACK1组照射后瘤体生长缓慢,瘤体体积减小幅度低于对照组(P<0.05),瘤体质量低于对照组(P<0.05)。结论下调RACK1表达可以增强口腔鳞癌细胞的放射敏感性,为提高口腔鳞癌放射敏感性研究提供新思路。