沉默HSF1基因诱导TGF-β/Smad信号通路对口腔癌细胞放疗抵抗的作用机制

目的探讨沉默热休克因子(HSF)1基因诱导转化生长因子(TGF)-β/Smad信号通路对口腔癌细胞放疗抵抗的作用机制。方法构建放疗抵抗细胞株SCC-9R,将细胞分为空白组、阳性慢病毒(NC)组和HSF1组。比较HOEC细胞和SCC-9细胞中HSF1表达[实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测]、细胞克隆细胞数、侵袭能力(Transwell小室法检测)、凋亡能力(流式细胞仪检测)及细胞中TGF-β1和Smad7蛋白表达(Western印迹检测)。结果HSF1在正常人口腔上皮细胞HOEC中表达较低,和HOEC细胞相比,人口腔鳞状细胞癌SCC-9细胞和抵抗细胞SCC-9R细中HSF1表达显著增加,且抵抗细胞SCC-9R中HSF1表达明显高于SCC-9细胞(P<0.05)。HSF1组CC-9/SCC-9R细胞中HSF1表达均明显少于空白组和NC组,且沉默HSF1可降低CC-9/SCC-9R细胞中HSF1表达(P<0.05)。克隆实验结果显示,空白组和NC组SCC-9和SCC-9R细胞克隆形成数均无明显差异(均P>0.05);HSF1组SCC-9和SCC-9R细胞克隆形成数较空白组和NC组显著减少(P<0.05)。细胞侵袭实验结果显示,空白组和NC组SCC-9和SCC-9R细胞侵袭能力无显著差异(P>0.05);HSF1组细胞侵袭能力较空白组和NC组明显降低(P<0.05)。细胞凋亡结果显示,空白组和NC组SCC-9和SCC-9R细胞凋亡能力无显著差异(P>0.05);HSF1组SCC-9和SCC-9R细胞的凋亡能力较空白组和NC组细胞明显增加(P<0.05)。HSF1组CC-9/SCC-9R细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达明显低于空白组和NC组(P<0.05)。结论沉默HSF1可抑制口腔鳞状细胞癌中TGF-β1、Smad7表达,可逆转放疗抵抗口腔癌细胞对放疗的抵抗作用。

基于TGF-β/Smad信号通路探究HSF1基因对CAL-27细胞放疗抵抗作用机制

目的基于TGF-β/Smad信号通路探究HSF1基因对CAL-27细胞放疗抵抗作用机制。方法用人口腔鳞癌细胞CAL-27建立放疗抵抗模型,随机分为抵抗组(放射抵抗CAL-27细胞)、NC组(放射抵抗CAL-27细胞转染空载体)、HSF1组(放射抵抗CAL-27细胞转染HSF1shRNA干扰慢病毒载体)。18只SD裸鼠分为口腔癌抵抗组(注射放射抵抗CAL-27细胞)、沉默HSF1组(注射HSF1shRNA干扰慢病毒载体放射抵抗CAL-27细胞),每组各9只。RT-PCR与Western blot检测HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7基因及蛋白水平。流式细胞仪检测各组口腔癌细胞凋亡情况。双荧光素酶报告基因分析HSF1与TGF-β/Smad2/Smad3靶向关系,游标卡尺测量瘤体并计算瘤体体积。结果放疗前,CAL-27口腔癌细胞形态无变化。放疗后,放疗抵抗口腔癌细胞株排列更加紊乱且细胞数目明显增加。抵抗组CAL-27口腔癌细胞中HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad7基因与蛋白表达水平与NC组比较无显著差异(P>0.05)。与NC组相比,HSF1组CAL-27口腔癌细胞中HSF1、TGF-β、Smad2、Smad3基因与蛋白表达水平降低,Smad7基因与蛋白表达水平升高(P<0.05),HSF1与TGF-β、Smad2及Smad3表达水平呈现正相关性(P<0.05),与Smad7表达水平呈现负相关性(P<0.05)。抵抗组CAL-27口腔癌细胞凋亡率与NC组比较无显著差异(t=0.891,P=0.394),NC组细胞凋亡率低于HSF1组,组间比较差异显著(t=24.110,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验发现,与pcDNA3.1相比,转染pcDNA3.1-HSF1后野生型TGF-β/Smad2/Smad3活性升高。口腔癌抵抗组裸鼠瘤体体积明显高于沉默HSF1组(t=7.379,P<0.001)。结论沉默HSF1表达可促进口腔癌放疗抵抗细胞凋亡,降低裸鼠瘤体体积,其作用机制可能与调控TGF-β/Smad有关,可提高口腔癌放疗敏感性。

小分子热休克蛋白HSPB1通过上调SIRT1减轻H_(2)O_(2)诱导的人血管内皮细胞早衰

目的:观察小分子热休克蛋白HSPB1是否减轻过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))诱导的人血管内皮细胞早衰,并从沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)信号通路来探讨其可能的作用机制。方法:将常规培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)随机分为空白对照组、50μmol/L H_(2)O_(2)组和H_(2)O_(2)+HSPB1过表达组。通过RT-qPCR法检测p16和p21的mRNA表达;衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)活性检测试剂盒检测SA-β-Gal活性;Western blot检测p53、p16、p21、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的蛋白水平;流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。同时,通过沉默SIRT1基因,观察SIRT1对HSPB1减缓H_(2)O_(2)诱导HUVECs衰老的影响。结果:与H_(2)O_(2)组比较,HSPB1过表达可减轻H_(2)O_(2)诱导的HUVECs损伤,包括p16和p21 mRNA水平降低、SA-β-Gal活性及ROS水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。同时,HSPB1过表达可使p53、p16、p21、VCAM-1和ICAM-1蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。沉默SIRT1基因可逆转HSPB1对p16和p21 mRNA表达及组蛋白H2AX磷酸化的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。同时,沉默SIRT1基因导致HSPB1抑制SA-β-Gal活性作用也显著减弱(P<0.01)。另外,SIRT1 siRNA逆转了HSPB1对p53、p21及p16蛋白表达的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论:小分子热休克蛋白HSPB1能够有效减轻H_(2)O_(2)诱导的HUVECs早衰,其机制与激活SIRT1信号通路,抑制氧化应激反应有关。

热休克转录因子1和血管内皮生长因子在肝癌组织中的表达及其对血管生成的影响

目的探讨热休克转录因子1(heat shock transcription factor 1,HSF1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肝癌组织中的表达以及对肝癌血管生成的影响。方法通过免疫组化法检测HSF1、VEGF在68例肝癌组织中的表达水平,分析其临床病理特征。通过siRNA沉默PLC/PRF5肝癌细胞HSF1基因表达。利用小管形成实验观察小管形成,ELISA实验检测细胞VEGF分泌情况,最后通过WB实验检测HSF1、pP13K、pAKT、mTOR蛋白的表达。结果免疫组化实验提示:HCC组织HSF1、VEGF在肝癌组织中的阳性表达率分别为67.65%(46/68)和66.18%(45/68),均高于癌旁组织的14.71%(10/68)和19.12%(13/68),差异有统计学意义(P<0.001)。HSF1表达与HBsAg、肝内PVTT/HVTT形成、微血管侵犯、病理分期相关(P<0.05或0.01),与肿瘤大小等无关(P>0.05)。VEGF的表达与微血管侵犯、肝内PVTT/HVTT形成、病理分期相关(P<0.05或0.01),与HBsAg、肿瘤分化程度等无关(P>0.05)。HSF1表达和VEGF表达呈正相关(r=0.287,P=0.018)。和Mock/PLC/PRF5组相比,sh/PLC/PRF5组明显抑制小管形成、VEGF分泌,下调HSF1、VEGF、pP13K、pAKT、mTOR蛋白的表达。结论肝癌组织中HSF1和VEGF的表达可促进肝癌肿瘤血管生成,其作用机制可能和P13K/AKT/mTOR通路有关。

β-石竹烯通过激活HSF1/HSP70通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探究β-石竹烯(β-caryophyllene,BCP)通过激活热休克转录因子1(heat shock factor 1,HSF1)/热休克蛋白70(heat shock proteins 70,HSP70)通路减轻大鼠脑缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion,CIR)损伤的机制。方法:将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、BCP低、中、高剂量组(204,306,408 mg·kg^(-1))、BCP(306 mg·kg^(-1))+Kribb11组和Kribb11组。采用线栓法建立大鼠CIR模型,再灌注24 h后进行神经行为学评分;2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法测定脑梗死体积;苏木精-伊红染色、尼式染色观察皮层神经元病理变化;蛋白印迹法检测大鼠脑皮层中HSP70,HSF1,p-HSF1和凋亡相关蛋白(Chop,Caspase 3,Bcl2,Bax)的蛋白表达;免疫荧光染色检测p-HSF1和HSP70蛋白表达;Tunel染色检测细胞凋亡水平;化学比色法检测皮层组织中丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(SOD)及Caspase 3活性。结果:与模型组相比,BCP组大鼠脑梗死体积明显降低(P<0.01),组织中HSF1,p-HSF1,HSP70和Bcl2蛋白表达显著增加(P<0.01),Bax,Chop,Caspase 3蛋白表达均明显减少(P<0.01),组织中MDA含量减少(P<0.01)和SOD的活性增加(P<0.01),Caspase 3酶活性显著降低(P<0.05),细胞凋亡减少,从而改善了缺血再灌注损伤;与BCP组相比,BCP+Kribb11组中Kribb11拮抗了BCP的疗效作用,HSF1,p-HSF1和HSP70蛋白表达显著减少(P<0.05,P<0.01),组织氧化应激水平升高,皮层细胞死亡增多,CIR损伤加重。结论:BCP能够降低氧化应激水平,抑制细胞凋亡,从而改善大鼠CIR损伤,其机制可能与激活HSF1/HSP70通路有关。

脑泰方调控细胞铁转运抑制铁死亡保护脑卒中缺血损伤的机制研究

目的探讨脑泰方是否通过调控热休克转录因子1(heat shock factor 1,HSF1)/热休克蛋白B1(heat shock proteins B1,HSPB1)通路降低脑铁沉积、抑制活性氧沉积及脂质过氧化产物产生、减轻神经元铁死亡,从而发挥脑卒中缺血损伤保护作用。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、脑泰方(27 g/kg)组和去铁酮(125 mg/kg)组,给予药物干预。通过大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法制备脑缺血大鼠模型,术后2 h进行神经功能评分及取材。TTC染色法检测脑梗死体积;苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织形态结构及损伤情况;尼氏染色观察脑组织尼氏体数目;普鲁士蓝染色观察脑组织神经元内铁聚集水平;免疫组化及Western blotting法检测脑组织HSF1、HSPB1、转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)和铁蛋白重链多肽(ferritin heavy polypeptide1,FTH1)蛋白表达;铁离子检测试剂盒与丙二醛检测试剂盒及活性氧检测试剂盒检测脑组织铁、丙二醛及活性氧含量。结果与模型组比较,脑泰方组大鼠脑梗死体积减少,神经功能评分降低(P<0.01);脑缺血区尼氏体增多,细胞损伤程度降低;含铁聚集颗粒细胞的数目减少;脑铁、丙二醛及活性氧含量降低(P<0.05、0.01);脑组织HSF1、HSPB1及FTH1蛋白表达上调(P<0.05、0.01),TFR1蛋白表达下调(P<0.05)。结论脑泰方可能通过上调HSF1/HSPB1通路,抑制TFR1的表达以减少神经元铁的吸收,上调FTH1的表达以增加铁蛋白的铁存储,以此调控铁代谢稳态平衡,进而抑制因过量的铁通过芬顿反应产生的活性氧及随后脂质过氧化产物引起的缺血性脑卒中神经元铁死亡。