MTB Hsp16.3重组蛋白通过Fractalkine/CX3CR1信号轴调控小鼠肺泡巨噬细胞M2型极化

目的初步探讨Fractalkine/CX3CR1信号轴在MTB Hsp16.3重组蛋白诱导小鼠肺泡巨噬细胞向M2型极化中的作用及机制。方法提取小鼠肺泡巨噬细胞,观察细胞形态后用其特异性标志CD68鉴定;MTB Hsp16.3(100 ng/mL)刺激肺泡巨噬细胞后,采用Real-time qPCR检测TNF-α、Arg-1等极化相关分子mRNA表达水平,Western blot检测Fractalkine、CX3CR1的表达情况。用慢病毒干扰肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达后,荧光显微镜观察病毒感染情况;流式细胞术检测感染效率;Real-time qPCR和Western blot检测感染前后肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达情况。采用MTB Hsp16.3刺激慢病毒感染过的肺泡巨噬细胞,Real-time qPCR检测各组极化相关分子mRNA表达水平;Western blot检测CD206、Arg-1的蛋白表达情况。利用Western blot检测各组中JNK、p38、ERK的磷酸化水平。结果显微镜下观察发现新分离的肺泡巨噬细胞为圆形,大小不等,约2 h后贴壁较牢,24 h后,肺泡巨噬细胞呈圆形、梭形等多种形态,且胞体更大,通过CD68鉴定为肺泡巨噬细胞;经MTB Hsp16.3处理后巨噬细胞TGF-β、IL-10、Arg-1、Fizz1的mRNA水平明显增高(P<0.05),巨噬细胞表面Fractalkine、CX3CR1的表达增高(P<0.05),与JNK、p38的磷酸化水平升高(P<0.05)相关。干扰肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达后,慢病毒感染效率在72 h达到最高峰,并且可降低巨噬细胞表面CX3CR1的表达。经MTB Hsp16.3刺激慢病毒感染过的肺泡巨噬细胞发现,TGF-β、IL-10、Arg-1、Fizz1 mRNA水平降低(P<0.05),CD206、Arg-1的表达水平降低(P<0.05),与JNK、p38磷酸化水平被抑制(P<0.05)相关。结论Fractalkine/CX3CR1信号轴可能参与调控MTB Hsp16.3重组蛋白诱导的肺泡巨噬细胞M2型极化,并且可能通过激活JNK、p38的磷酸化水平发挥作用。

结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用。方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数。提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化。结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P<0.05)。结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成。

TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠巨噬细胞过程中表达及作用的初步探讨

目的:在体外细胞水平,初步探讨TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞的表达及作用。方法:从BALB/c小鼠的胫腓骨中取骨髓细胞,与GM-CSF共培养获得骨髓来源的M0型巨噬细胞,流式检测F4/80和CD11b的表达并观察其形态;100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激M0巨噬细胞,分别培养0、12、24、36、48、72 h,Real-time PCR检测不同时间点TLR2/4的表达水平;利用RNAi干扰技术沉默巨噬细胞表面的TLR2/4受体,MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0巨噬细胞,分别培养0、12、24、36、48、72 h,Real-time PCR检测不同时间点TLR2/4及Ym-1、Fizz1、IL-10、TNF-α、i NOS、TGF-β细胞因子的表达水平。结果:M0型巨噬细胞在MTB Hsp16.3刺激后出现了较短的伪足,沉默TLR2/4的M0型巨噬细胞在MTB Hsp16.3刺激后出现了较长伪足;M0巨噬细胞在MTB Hsp16.3刺激后高表达TLR2/4。MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0型巨噬细胞,高表达M1型巨噬细胞相关的细胞因子IL-6、TNF-α、i NOS,低表达M2型巨噬细胞相关的细胞因子IL-10、TGF-β、Ym-1、Fizz1。结论:MTB Hsp16.3通过TLR2/4促进M0型巨噬细胞向M2型转化,抑制M1型巨噬细胞,这可能参与了MTB躲避巨噬细胞的吞噬过程。

结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3分泌表达模型的建立及鉴定

为了建立及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3分泌表达的模型。采用将0.3mL浓度约为1.0×107个/mL结核分枝杆菌菌悬液经昆明小鼠尾静脉注射,复制结核分枝杆菌感染小鼠模型,经鉴定小鼠感染模型复制成功后第15天,进行小鼠肺泡的灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取感染小鼠肺泡巨噬细胞,以提取的感染小鼠肺泡巨噬细胞内的结核分枝杆菌基因组DNA为模版PCR扩增结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3的基因,同时进一步利用激光共聚焦显微镜观察小鼠肺泡巨噬细胞的方法进行研究。PCR结果证实感染结核分支杆菌的巨噬细胞内有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的基因表达;同时激光共聚焦显微镜下可见感染小鼠肺泡巨噬细胞内吞噬有大量结核分枝杆菌,并且证实有结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的分泌表达。成功建立了结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞诱导结核分枝杆菌小分子热休克蛋白HSP16.3分泌表达的模型。

结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因克隆以及表达

目的克隆结核分枝杆菌蛋白Hsp16.3的基因,在大肠杆菌中进行表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对Hsp16.3的基因进行扩增,以pET30a为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的Hsp16.3重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。

结核分枝杆菌Hsp16.3单克隆抗体的制备及其特性鉴定

制备抗结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。将含目的基因的表达载体pProEXHTb-Hsp16.3,通过E.coli DH5α诱导表达,获得含有6×His的Hsp16.3蛋白,采用Ni-NTA纯化试剂盒进行目的蛋白的纯化,并用透析方法进行蛋白复性。将复性的蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将获得的Hsp16.3阳性杂交瘤细胞株分别利用间接ELISA法和Western blot方法进行效价、相对亲和力及特异性的测定。获得了三株Hsp16.3的单克隆抗体,分别命名为3H6F9、1D5E1和4H8G6,其效价分别为1:1×107、1:1×106和1:1×106,相对亲和力分别为0.000 1 mg/mL、0.001 mg/mL和0.001 mg/mL,并且无交叉反应性。所获得的结核分枝杆菌Hsp16.3的单克隆抗体效价高、特异性强,为进一步研究Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用提供了有效的工具。

卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

目的构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体。方法体外培养卡介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5'-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定。结果构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因。结论成功构建出卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体。

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3及其合成肽在小鼠体内诱导的免疫应答

目的比较结核分枝杆菌Hsp16.3和Hsp16.3合成肽在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力。方法80只BALB/c小鼠随机分5组共免疫3次,间隔2周。分别于0、2、4、6、8周采集血液,ELISA法检测在抗原Hsp16.3和Hsp16.3合成肽包被时血清中的抗体浓度及第8周时血清中的抗体滴度。末次免疫完成后4周,取每组8只免疫小鼠分离脾淋巴细胞,用Hsp16.3和Hsp16.3合成肽分别刺激后,MTT法测定脾淋巴细胞的增殖指数,夹心ELISA法检测同样抗原刺激下脾淋巴细胞诱生的IFN-γ水平。每组剩余小鼠用H37Rv毒株攻击,4周后取小鼠脾脏分离脾淋巴细胞,倍比稀释后涂平板,3周后计数CFU。结果抗Hsp16.3和Hsp16.3合成肽的抗体在免疫的前4周均增长迅速,而后趋于缓和。Hsp16.3/DDA/MPL、Hsp16.3合成肽/DDA/MPL、Hsp16.3合成肽/FIA、BCG组和生理盐水组在第8周时抗Hsp16.3的抗体滴度分别为1:3000、1:1500、1:1500、1:500和1:100,抗Hsp16.3合成肽的抗体滴度分别为1:2000、1:2000、1:1000、1:500和1:100;在Hsp16.3和其合成肽的刺激下,各组平均刺激指数分别为(3.13±0.18)和(2.895±0.13)、(3.21±0.21)和(3.54±0.2)、(2.395±0.15)和(3.125±0.12),(1.67±0.12)和(1.93±0.14),(1.04±0.09)和(1.16±0.08);在同样抗原刺激下,各组诱生的IFN-γ水平分别为(182.43±6.01)pg/mL和(182.43±8.67)pg/mL、(193.522±9.26)pg/mL和(198.915±6.16)pg/mL、(179.135±7.83)pg/mL和(188.32±5.13)pg/mL,(274.56±10.26)pg/mL和(283.47±6.19)pg/mL,(71.14±3.34)pg/mL和(72.91±2.45)pg/mL;各组脾脏的荷菌数分别为(6.74±0.14)、(6.60±0.13)、(6.81±0.28)、(5.95±0.17)和(7.82±0.21)。结论二者在免疫学特性方面各有优势,提示Hsp16.3和Hsp16.3合成肽均有望成为TB疫苗的候选组分。

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与Hsp16.3在大肠杆菌中融合表达并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR方法从质粒pProEX HTb-Hsp16.3扩增Hsp16.3基因,引入48bp的柔性linker结构以确保两蛋白的正确折叠。将目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的基因片段双酶切后,替换质粒pProEX HTa-Ag85B-ESAT6中的ESAT6基因,从而获得重组质粒pProEX HTa-Ag85B-Hsp16.3,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及活动期结核病人血清进行Western blot分析鉴定,采用镍柱亲合色谱法对融合蛋白进行纯化。结果 PCR扩增获得的目的基因与GenBank报道的一致。SDS-PAGE分析显示构建的融合蛋白在大肠杆菌中表达,且该融合蛋白能够分别与抗Ag85B多抗和抗Hsp16.3单抗以及结核病人血清反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析可获得纯化的Ag85B-Hsp16.3融合蛋白。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究其生物学功能提供了基础。

结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的高效自发再折叠和再组装

来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3以九聚体的形式存在 .用三种不同的强变性条件 (10 0℃加热15min ,12mol/L脲或 8mol/L盐酸胍处理 4h)将Hsp16 3变性 ,然后通过冷却或透析使之复性 ,并利用孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和圆二色性光谱比较了变性 复性前后Hsp16 3的各个层次高级结构 .结果显示 ,变性的Hsp16 3几乎可以完全恢复至天然构象 ,这表明小分子热休克蛋白Hsp16 3具有很强的自发折叠和组装能力 .

Leu122对Hsp16.3组装过程中亚基相互作用的影响

小分子热休克蛋白是种类最多的热休克蛋白家族 ,它们均以寡聚体的形式存在 .研究表明 ,来自结核杆菌的小分子热休克蛋白Hsp16 3是以 3个三聚体的形式存在的九聚体 .为了探讨Hsp16 3体外组装过程中的亚基相互作用和识别 ,利用野生型Hsp16 3及其L12 2A突变体蛋白为模型 ,采用高效液相分子筛层析、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和脲梯度凝胶电泳等方法进行研究 .结果表明 ,Hsp16 3在体外能自发地再组装成九聚体 .12 2位的亮氨酸残基对Hsp16 3体外再组装过程中的亚基相互作用有重要的影响 ,并且在Hsp16 3的组装过程中 ,亚基之间的相互识别是高度灵敏和特异的 ,野生型蛋白的亚基和L12 2A突变体蛋白的亚基并不能形成杂合体 。

关于小分子热休克蛋白Hsp16.3各功能区作用的初步研究

小分子热休克蛋白Hsp16.3是一种存在于结核杆菌中的重要抗原,具有小分子热休克蛋白家族成员典型的3个功能区:N端疏水区,α-crystallin域和C端较短的非保守区.为了进一步研究其各功能区的作用,我们定义了Hsp16.3的3个功能区并在大肠杆菌中分别克隆、表达和纯化了N端区或C端区缺失的两个Hsp16.3残体蛋白.远紫外和近紫外圆二色谱分析结果显示,残体蛋白表现出与野生型蛋白相似的二级和三级结构.在九聚体野生型蛋白进行亚基重组装时,C端缺失的Hsp16.3残体蛋白能与野生型蛋白发生相互作用,形成异源寡聚体.在对野生型蛋白进行胰酶消化时,Hsp16.3的α-crystallin域对胰酶的消化具有抵抗能力.所有这些结果显示:在Hsp16.3的3个功能区中,α-crystallin域是一个相对独立和稳定的结构单元,它对该蛋白各级结构的维持十分重要.

结核分枝杆菌Hsp16.3的表达、纯化和鉴定

目的克隆结核分枝杆菌hspx(acr、Rv2031c)基因,扩增后测序,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白Hsp16.3(Heat Shock Protein16.3)。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出hspx基因片段,连接进入pTA2载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProEX HTb并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白SDS-PAGE分析后,分别与6×His mAb、16k Da mAb和结核病人血清进行Western-blot,最后用Ni-NTA进行亲和层析纯化蛋白。结果获得结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白基因,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致;表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量与文献报道一致;Western-blot结果显示,在相对分子量约16kDa处有与6×His mAb和鼠抗16k Da mAb的特异性结合带,而与结核病人血清杂交没有出现结合带。表达产物为包涵体,通过Ni-NTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白。结论成功地表达、纯化和鉴定了Hsp16.3蛋白,它有可能作为新型结核疫苗的靶抗原。

Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏感染中的作用

结核病(Tuberculosis,TB)主要是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的细菌感染性疾病.当宿主免疫力减弱,潜伏感染的Mtb得以复苏,导致TB感染的复发.巨噬细胞自噬作为宿主先天性和适应性免疫反应的重要组成部分,在保护宿主抗Mtb感染方面发挥着重要作用.热休克蛋白16.3(Hsp16.3)是Mtb潜伏感染(LTBI)期间表达的重要蛋白,它可能通过抑制巨噬细胞自噬而维持Mtb长期生存,从而导致LTBI的发生.本文综述了Hsp16.3在LTBI中调控巨噬细胞自噬的作用,期望Hsp16.3能够成为LTBI的生物标志物和抗结核药物的新靶点.

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化

探讨结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的影响及其时相性变化。用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时期感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,比较结核分枝杆菌Hsp16.3基因缺失突变株与正常株感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率的时相性变化。激光共聚焦显微镜检测结果显示:结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株(△H37Rv)、卡介苗菌株(BCG)以及卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变株(△BCG)均被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。流式细胞技术检测结果显示:小鼠感染△H37Rv菌株后,巨噬细胞的凋亡率逐渐上升,至感染7d时达到高峰,随后逐渐降低,1～7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组,9～11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率反而低于H37Rv菌株组,但13～15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率又呈现出比H37Rv感染组高的现象,差异均有统计学意义(P<0.05)。△BCG组凋亡率1～7d内呈现明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳,且1～5d内,△BCG组凋亡率显著高于BCG组(P<0.05),7～15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异。结果表明:与结核分枝杆菌H37Rv株野生株相比,结核分枝杆菌H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变株在感染的早期和晚期对小鼠肺泡巨噬细胞有更强的致凋亡作用,而这种致凋亡作用与结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关,说明在结核分枝杆菌感染的早期和晚期,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3的表达能够抑制宿主巨噬细胞的凋亡。

重组结核分枝杆菌Hsp16.3的纳米金免疫传感器检测Hsp16.3抗体

克隆和表达结核分枝杆菌热休克蛋白16.3(Hsp16.3),建立纳米金免疫传感器检测结核病患者血清Hsp16.3抗体。PCR扩增hsp16.3基因,构建重组表达质粒pQE30-hsp16.3,表达和纯化Hsp16.3,Western blot分析其反应原性;晶种生长法制备金纳米棒并连接Hsp16.3,建立纳米金免疫传感器检测血清Hsp16.3抗体,接受者操作特性(ROC)曲线评价其灵敏度和特异性。成功构建重组表达质粒pQE30-hsp16.3,纯化Hsp16.3具有良好的反应原性;Hsp16.3的纳米金免疫传感器分别检测50例结核病患者、42例非结核肺病患者和50例体检健康者血清,红移值大于3.5的例数分别为42、7、1例;ROC曲线显示,曲线下面积0.888(P<0.01),界值3.5,灵敏度82%,特异性98%。结果表明,Hsp16.3的纳米金免疫传感器可用于检测结核病血清Hsp16.3抗体。

结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性研究

目的建立结核分枝杆菌感染RAW264.7株巨噬细胞模型,研究结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性。方法分别用结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株和卡介苗菌株感染RAW264.7巨噬细胞株,于感染后1、3、6及12h,利用激光共聚焦显微镜鉴定卡介苗及结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株感染RAW264.7巨噬细胞模型;同时利用流式细胞技术于上述各时间点检测各组感染巨噬细胞的凋亡率,并分析其时相性变化;利用PCR技术扩增模型目的基因,利用Western blot检测上述各个时间点Hsp16.3蛋白表达水平的时相性变化。结果激光共聚焦显微镜下观察到RAW264.7巨噬细胞内有标记MTB16KD的绿色荧光,证实结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型构建成功。巨噬细胞感染结核分枝杆菌后凋亡率升高,其中感染后1、3和12h凋亡率H37Rv感染组与BCG感染组比较差异有统计学意义(P<0.05);巨噬细胞感染结核分枝杆菌后的PCR产物大小为435bp;感染细胞Hsp16.3蛋白表达升高,其中感染后1h和3h升高更显著。结论结核分枝杆菌感染可导致巨噬细胞凋亡,感染巨噬细胞的凋亡率与菌株毒力强弱有关,弱毒力结核分枝杆菌感染的巨噬细胞早期凋亡更显著;结核分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡与结核分枝杆菌表达Hsp16.3水平高低有关,在感染早期强毒力结核分枝杆菌Hsp16.3表达水平较高。

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp16.3的表达、纯化及鉴定

目的构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3原核表达载体,获得Hsp16.3蛋白,并进行纯化及鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增Hsp16.3基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28a-Hsp16.3,测序正确后,转入宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达。融合蛋白经SDS-PAGE,Western blot分析鉴定,并通过镍柱进行亲和层析纯化,表达蛋白分子质量约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结果成功构建了Hsp16.3原核表达载体pET28a-Hsp16.3,并在宿主菌BL21(DE3)中表达,表达蛋白分子质量单位约17ku,能被结核杆菌16ku单抗和小鼠抗His Tag单抗识别。结论 Hsp16.3基因克隆入宿主菌中并成功表达,纯化Hsp16.3蛋白具有生物学活性,为Hsp16.3的进一步研究奠定了基础。

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中的初步应用

目的:探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法:将已构建的含5种目的基因的表达载体(pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6),分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果:五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论:Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3功能及与结核病的关系研究进展

结核病依然是对人类健康具有极大威胁的传染性疾病之一,而结核分枝杆菌能在巨噬细胞内长期存活是其引起结核病的主要因素之一。近年研究发现,结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3是在结核分枝杆菌进入宿主巨噬细胞后大量表达的一个存在于膜上的主要抗原蛋白。由于结核分枝杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3在结核分枝杆菌潜伏于宿主巨噬细胞过程中扮演的重要角色,其已经越来越受到人们的关注。