HSP65-MUC1 VNTR_2融合蛋白的表达、纯化及其抗肿瘤作用

目的:通过基因工程手段在大肠杆菌中表达HSP65-MUC1VNTR2融合蛋白、鉴定和纯化,并研究其在动物体内的肿瘤生长抑制活性。方法:通过PCR获得结核分支杆菌HSP65基因,以重叠PCR获得人MUC1基因VNTR的2个重复序列,构建原核重组表达载体HSP65-MUC1VNTR2-pET28a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG诱导表达;利用单克隆抗体(mAb)进行Westernblot鉴定,以Q柱和凝胶过滤纯化获得纯化蛋白。通过建立转染人MUC1基因的B16黑色素瘤小鼠肿瘤模型,在C57BL/6小鼠体内研究HSP65-MUC1VNTR2融合蛋白的肿瘤生长抑制活性。结果:获得的结核分支杆菌HSP65基因和人MUC1基因VNTR区的2个重复片段,经测序证明分别与GenBank中结核杆菌HSP65基因和人MUC1基因的VNTR完全相符;构建的原核表达载体HSP65-MUC1VNTR2-pET28a(+)可稳定的可溶性表达HSP65-MUC1VNTR2蛋白;经Q柱和凝胶过滤纯化,纯化的目的蛋白纯度达95%以上;利用鼠抗人MUC1mAb对表达蛋白进行验证,结果阳性;小鼠肿瘤预防免疫实验表明,实验组小鼠抑瘤率大于对照组,且具有明显性差异。结论:成功地利用原核表达系统实现了对HSP65-MUC1VNTR2蛋白的可溶性表达,并对其体内预防实验进行了初步研究,证明该融合蛋白能明显抑制表达MUC1的肿瘤生长。为进一步评价其作为肿瘤疫苗可能性的研究打下了基础。

HSP65-MUC1融合蛋白中试生产工艺的优化及生物学活性检测方法的鉴定

目的优化HSP65-MUC1融合蛋白的中试生产工艺,并建立稳定的生物学活性检测方法。方法通过发酵技术获得大量表达HSP65-MUC1的大肠杆菌,高压均质机破菌获得上清液,经不同浓度的饱和硫酸铵、疏水层析、离子交换层析三步纯化后,以期获得高纯度、高质量的融合蛋白HSP65-MUC1;利用流式细胞仪检测HSP65-MUC1作用后,人外周血来源的树突状细胞(DC)表达CD86分子的能力。结果含有pET28a-HSP65-MUC1重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)能有效表达目的蛋白,10 g发酵菌体经饱和硫酸铵沉淀、phenyl sepharose FF层析柱和Q FF离子交换层析柱纯化后,可获得413.7 mg、纯度高达96%的目的蛋白;同时与阴性对照相比(10.13%±0.89%),纯化的HSP65-MUC1能显著提高DC细胞表面CD86分子的表达(29.98%±1.02%)。结论 HSP65-MUC1的中试生产工艺得到了有效的优化,同时鉴定了其生物学活性,从而为临床研究提供基础。

接种卡介苗对热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白抑瘤作用的影响

目的:探讨接种卡介苗对热休克蛋白65-MUC1抗原肽融合蛋白(HSP65-MUC1)所激发的抑瘤作用的影响。方法:给经卡介苗免疫后产生HSP65抗体的小鼠注射HSP65-MUC1融合蛋白3次,然后给小鼠接种MUC1阳性的B16肿瘤细胞,观察HSP65-MUC1融合蛋白对MUC1阳性的B16肿瘤细胞在已产生HSP65抗体的小鼠体内生长的抑制作用。结果:HSP65-MUC1能够显著抑制MUC1阳性的B16肿瘤细胞在已产生HSP65抗体小鼠体内的生长,HSP65-MUC1组小鼠的肿瘤重量和体积显著地低于PBS组。结论:接种卡介苗并不影响HSP65-MUC1所激发的对MUC1阳性B16肿瘤细胞生长的抑制作用。

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis—An environmental trigger of type 1 diabetes mellitus

Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is an autoimmune disease. The etiology of T1DM is incompletely understood but environmental agent(s) are thought to trigger T1DM in the genetically at-risk. Humans are widely exposed to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), a proven multi-host chronic enteric pathogen that is mostly studied in ruminant animals and causes the inflammatory disease paratuberculosis or Johne’s disease. In humans, MAP is the putative cause of Crohn’s disease and has been linked to sarcoidosis, autoimmune thyroiditis, multiple sclerosis and autoimmune diabetes. The role of MAP as a trigger for T1DM was first postulated in 2005;subsequent studies suggest a link. This article discusses MAP, human exposure to MAP, genetic susceptibility to MAP and MAP in human disease including T1DM.

乙酰葛根素对氧糖剥离诱导海马神经元凋亡的影响

目的研究新型异黄酮类化合物乙酰葛根素对氧糖剥离神经元的保护作用及其机制。方法采用氧糖剥离建立细胞模型。DAPI法观察神经元凋亡率,RT-PCR法检测NF-κBp65、HIF-1α及p53mRNA的表达,Western blot法测定Hsp70蛋白的含量及乙酰葛根素对其的影响。结果与模型组相比较,乙酰葛根素可以减少凋亡细胞数;降低NF-κBp65、HIF-1α及p53mRNA表达;乙酰葛根素(低,中和高浓度组)增加Hsp70蛋白的表达。结论乙酰葛根素降低NF-κBp65、HIF-1α、p53的表达和升高Hsp70蛋白表达。