家蚕hsp70启动子的克隆及功能研究

该研究通过PCR的方法克隆得到家蚕热激蛋白70基因(Bombyx mori hsp70)的5'侧翼的两个长度分别为538 bp和305 bp的序列hsp70-538和hsp70-305。生物信息分析结果表明这两段序列在TATA序列的上游存在保守的热激元件HSE(heat shock element)CTnGAAnnTTCnAG。采用双荧光报告基因技术研究表明这两段序列在BmN细胞中都表现出热激活性,转基因家蚕实验证明hsp70-305在家蚕个体中也具有热激活性,可以认为这两个片段具有hsp70热激启动子特性。

拟南芥HSP70基因启动子表达载体的构建及在烟草BY2细胞中的应用

探讨了拟南芥的HSP70基因在液体悬浮培养的烟草BY2细胞中的表达及应用.用PCR扩增的方法从拟南芥col生态型基因组中扩增获得HSP70基因启动子序列,将其连入p1300表达载体且以GFP为报告基因,将该表达载体采用农杆菌转基因转入液体悬浮培养的烟草BY2细胞中,观察转基因细胞中报告基因GFP的表达情况.结果显示:HSP70:GFP转基因液体悬浮培养的烟草BY2细胞中有GFP的表达.该表达载体可在液体悬浮培养的BY2细胞中正常表达,且可在较短时间内获得大量实验材料,对拟南芥的HSP70基因启动子的进一步研究提供理论依据和丰富的实验材料,且可明显缩短实验周期.

Development of a Transient Assay for Investigating the Activation of Pea Hsp70 Gene Promoter by Potyviral Cistrons

建立了一个瞬时表达系统以研究豌豆种传花叶病毒 (PSbMV ,一种马铃薯Y类病毒 )不同基因对豌豆(PisumsativumL .)Hsp70基因启动子激活能力的差异。构建了豌豆Hsp70基因启动子指导下的GUS基因的表达载体 ,同时还制备了 35S启动子指导下的PSbMVP1和P3基因的表达载体。以表达载体DNA包被的金粉做子弹 ,利用基因枪对豌豆离体叶片进行共轰击实验 ,结果表明 ,PSbMVP1和P3基因在激活豌豆Hsp70基因启动子的能力上存在明显差异。

热激活的Vg1转基因文昌鱼品系构建及表型分析

[目的] Vg1作为Nodal信号通路的重要配体之一参与了早期胚胎发育过程中的背腹分化调控及左右不对称模式的建立.构建Vg1转基因文昌鱼品系以研究其在文昌鱼胚胎不同发育阶段的功能.[方法]结合Tol2转座子转基因系统和热敏启动子Hsp70构建文昌鱼BbHsp70-BfVg1稳定转基因品系;并用热激实验、表型统计和原位杂交等手段对该转基因品系的有效性进行评估.[结果]热激结果显示,在囊胚晚期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎背腹轴形成异常;在原肠胚中期热激处理Vg1转基因文昌鱼导致胚胎原本左右不对称的器官变为对称分布.基因表达分析结果显示,在囊胚晚期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的Vg1呈现全身性表达,背部中胚层标记基因Gsc表达扩张,腹部标记基因Evx表达下调,神经标记基因SoxB1a向腹侧蔓延;在原肠胚中期热激F1代胚胎中有部分比例胚胎的左侧特异基因Pitx呈现两侧对称表达,左侧口前窝标记基因Pit呈现两侧对称表达.[结论]初步构建了一个能够实现实时热激活Vg1的文昌鱼稳定转基因品系,并为后续在文昌鱼中进行基因功能研究提供了一个新手段.

Hsp70A-RBCS2融合启动子调控PHB合成酶基因在莱茵衣藻中的表达

利用Hsp70A-RBCS2融合启动子构建了新型的莱茵衣藻表达载体,并获得了聚-β-羟基丁酸(PHB)合成酶基因(phbC)的衣藻表达载体p105C124和pH105C124.通过"珠磨法"分别将上述两个衣藻表达载体导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC-849(Chlamydomonas reinhardtii CC-849)中,得到了具有Zeomycin抗性的转基因藻株.Hsp70A-RBCS2启动子介导的外源基因遗传转化效率明显高于RBCS2启动子,Southern杂交结果显示,phbC基因以低拷贝数整合进莱茵衣藻的基因组DNA中.在光照下,Hsp70A-RBCS2融合启动子能够有效调控phbC基因在莱茵衣藻中的转录和翻译,得到的蛋白产物具有PHB合成酶活性,40℃热激诱导可使PHB合成酶的酶活性提高到1.8倍.因此,Hsp70A-RBCS2融合启动子可使phbC基因在莱茵衣藻中实现可诱导的表达,该研究对利用衣藻合成PHB具有重要的学术意义,进一步的研究将通过"共转化"法获得二价或三价的转基因藻,最终实现在转基因藻中合成PHB.

加热调控的溶瘤腺病毒载体构建及其特征研究

溶瘤腺病毒作为近年来新兴的肿瘤基因治疗策略,因具有"细胞溶解"和"旁观者效应"而备受关注.构建了受热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体Ad-HSP70p-E1A,观察该病毒与热疗联合应用对肺癌细胞生长的抑制作用和带动治疗基因在肺癌细胞中表达的效果.体外实验结果表明,Ad-HSP70p-E1A在肺癌细胞株A549内能较好地实现自身复制,并产生一定的溶瘤作用,在联合热疗后,Ad-HSP70p-E1A的自身复制能力和溶瘤效果分别增强了2～10倍和5倍以上.此外,Ad-HSP70p-E1A还可通过反式提供E1A蛋白而使10moi用量的复制缺陷型腺病毒AdGFP、Ad-CMV-hGMCSF和Ad-CMV-mIL12的表达提升76.64倍、5倍和7倍.

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pY-α的构建

利用分子生物学方法 ,以含人结核杆菌热休克蛋白 ( HSP) 70基因全长序列的质粒 p MT 70为模板 ,扩增出 hsp70启动子 ,将其定向克隆于 p UC 1 9,构建成重组质粒 p Y6 0 1 3;然后以重组质粒 p IJK 1为模板 ,扩增出分枝杆菌α信号肽基因并将其克隆到 p Y6 0 1 3质粒中 hsp70启动子的下游 ,得到了大肠杆菌分枝杆菌表达质粒 p Y-α.

增强型绿色荧光蛋白在莱茵衣藻中的高效表达

莱茵衣藻素有“光合酵母”之称,是目前少数三套基因组均能进行遗传转化的生物。但由于莱茵衣藻细胞中存在复杂的表达调控体系、密码子偏爱等原因,莱茵衣藻的外源基因表达体系目前还处于探索阶段。通过构建两个莱茵衣藻外源基因表达载体,即以 RBCS2序列为启动子的 p105和以 HSP70A-RBCS2序列为启动子的 pH105,分别将增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)插入两个表达载体中,得到 p105G124和 pH105G124转化载体。然后通过“珠磨法”转化细胞壁缺陷的莱茵衣藻 cc-849,并得到两种类别的转基因藻 Tran-Ⅰ和 Tran-Ⅱ。在光诱导和热激诱导条件下,两种类型的转基因藻均能稳定表达绿色荧光蛋白。通过实验比较二者的转化效率和蛋白表达水平,结果显示 pH105可使 egfp 基因的转化效率提高8倍;HSP70A-RBCS2启动子至少使绿色荧光蛋白的表达水平提高了2倍,40℃热激后绿色荧光蛋白的表达量再提高约3倍。以上结果表明获得的pH105是一个高效、可诱导的莱茵衣藻外源基因表达载体,这为利用莱茵衣藻高效表达外源基因和开发生物反应器奠定基础。